摘要
锌指蛋白（Zincfingerproteins）是一类具有锌指结构域特征的超蛋白家族，是真核生物中分布最为广泛的转录因子家族之一，它们在基因表达、细胞分化、胚胎发育、肿瘤发生等生命过程中具有重要调控作用。C2H2型锌指蛋白也称TFIIIA型锌指蛋白(具有典型的CX2-4CX3FX5LX2HX3-5H结构)，参与植物生长发育（如种子萌发，形态建成，花器官发育，表皮细胞分化）以及逆境胁迫响应等过程调控。ZFP8属于C2H2型单锌指蛋白亚家族成员，AtZFP8基因被报道在拟南芥(ArabidopsisthalianaL.)表皮细胞发育方面具有特殊表现，然而关于烟草中ZFP8家族基因的表达规律及相关研究仍鲜有报道。本文以普通烟草(NicotianatabacumL.)中两个C2H2型锌指蛋白基因NtZFP8a和NtZFP8b为研究对象，对它们在烟草发育过程中的表达模式特征和规律展开多方面研究。预测比较了两基因序列和蛋白保守结构域、基因组织特异性表达特征和亚细胞定位观察、启动子启动活性分析，外源植物激素对基因表达的影响以及NtZFP8b基因参与的植物激素相关的调控机制初步探究，期望对NtZFP8基因在调控植物生长发育以及与植物激素之间的相互调控关系的研究提供思路和方向。主要研究结果如下： (1)通过对基因序列，保守结构域的预测分析发现两基因核苷酸序列高度同源（97.4%），无内含子，属于C2H2型锌指蛋白家族中的单锌指ZFP8-Like亚家族基因，命名为NtZFP8a和NtZFP8b。 (2)基因表达模式探究显示两基因在烟草发育各阶段的组织特异性规律基本一致。RT-qPCR定量显示基因在成熟烟草中表达量从高到低依次为：茎＞腋芽＞幼叶＞成熟叶＞花＞根。在花器官发育阶段，两基因转录水平也呈现出相同趋势的时空特异性，在花器官结构中表达量呈现出：花萼＞花冠叶＞柱头＞花药＞卵形子房＞花冠筒。 (3)NtZFP8a和NtZFP8b蛋白亚细胞定位预测显示基因大概率定位于细胞核内，核定位信号靠近N端。基因融合EGFP报告系统的亚细胞定位载体转染烟草原生质体后，融合基因的绿色荧光蛋白信号均聚集在烟草原生质体细胞核内，表明两基因表达蛋白定位于细胞核。 (4)两基因启动子区域序列预测显示两基因启动子区域具有多种组织特异性表达元件和多种植物激素（如细胞分裂素、生长素、赤霉素等）诱导响应元件。此外NtZFP8b基因启动子序列上有多个位置紧邻的细胞分裂素信号响应蛋白ARR1AT结合位点。 (5)构建两基因启动子驱动GUS报告系统的表达载体，转化本氏烟草后观察基因启动子驱动活性显示在本氏烟草茎、叶、花部分结构、以及萌发的种子子叶中GUS基因被驱动表达，但在根中始终没有检测到GUS蓝色。此外在烟草外植体愈伤再分化时期也能检测到GUS信号，暗示这两个基因可能参与了烟草外植体的再生分化过程。 (6)两基因的转录水平均受到外源植物激素的诱导影响，尤其是细胞分裂素6-BA诱导后，基因表达水平随着处理时间变化呈现出梯度趋势性变化。pNtZFP8b∷GUS植株转录活性受6-BA以及细胞分裂素信号转导抑制剂洛伐他汀的影响。体外酵母单杂交实验表明，细胞分裂素信号响应蛋白ARRs能结合NtZFP8b基因启动子，双荧光素酶的瞬时激活实验则表明ARRs蛋白结合NtZFP8b启动子后激活了基因的表达，导致荧光信号增强。据此，我们推测NtZFP8b基因在烟草生长发育过程中可能作为细胞分裂素信号转导通路中的成员之一来参与相关调控作用。
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