摘要
目的： 尽管早期局限性前列腺癌可以通过手术或放疗达到较好的治疗效果甚至是临床治愈，但转移性前列腺癌，特别是转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC），仍是一种无法治愈的终末阶段疾病。近二十年来，随着对前列腺癌疾病演进分子机制的逐渐明晰，明确了mCRPC阶段疾病演进的主要驱动因素仍然是以雄激素信号通路为主。包括新型抗雄药物在内的针对晚期前列腺癌治疗的各种新药研发及临床试验的成功，以及治疗理念的调整，使晚期前列腺癌患者总体生存得到了进一步的改善和延长。但客观上讲，由于mCRPC疾病演进分子机制纷繁复杂，肿瘤细胞极易产生对各种药物治疗的适应性改变或者药物抵抗，最终导致mCRPC患者在多样化治疗模式下生存时间的延长仍然有限。值得关注的是，针对雄激素信号的不同新型抗雄药物在分子结构和作用机制上的相似性，决定了此类药物之间可能存在交叉耐药性，这极大地影响了类似药物序贯治疗方案在延长前列腺癌患者生存中的治疗潜能。已有研究对恩扎卢胺、阿比特龙及多西他赛之间潜在存在的交叉耐药进行了报道。但目前为止，较新问世的抗雄药物阿帕他胺是否与其他抗肿瘤药物之间存在交叉耐药尚缺乏研究基础。 因此，本研究旨在探索新一代抗雄药物恩扎卢胺和阿帕他胺在前列腺肿瘤治疗过程中可能存在的交叉耐药，并试图阐明导致交叉耐药的分子机制，为最大限度地发挥不同抗雄药物的治疗效能奠定实验室依据和基础。 材料和方法： 本课题总体上分为基础实验和临床研究两大部分。基础实验部分主要包括以下步骤：1）通过在药物浓度逐渐递增的含有恩扎卢胺或阿帕他胺的培养基中对去势抵抗性前列腺癌细胞株C4-2B进行长期培养和定期传代，分别获得对恩扎卢胺和阿帕他胺耐药的稳定生长前列腺癌细胞株C4-2BMDVR及C4-2BAPALR；2）通过细胞增殖实验、克隆形成实验探索恩扎卢胺（或阿帕他胺）耐药细胞株C4-2BMDVR（或C4-2BAPALR）是否同时对阿帕他胺（或恩扎卢胺）耐药，从而对前列腺肿瘤治疗过程中恩扎卢胺与阿帕他胺之间的交叉耐药进行验证；3）通过RNA-seq测序分别探索C4-2B细胞在对恩扎卢胺或者阿帕他胺耐药前后转录组水平的改变，并通过qRT-PCR及WB技术从mRNA和蛋白层面对重要测序结果进行验证；4）通过双荧光素酶报告基因实验探索恩扎卢胺、阿帕他胺对AR、AR剪接变异体以及不同的AR突变体所引起的雄激素受体信号通路活化的抑制作用；5）下调C4-2BMDVR细胞、C4-2BAPALR细胞或者CWR22Rv1细胞中的AKR1C3、AR-V7水平后，观察肿瘤细胞耐药性的改变，并通过WB实验探索肿瘤细胞在蛋白层面的变化；6）上调C4-2Bparental细胞中AKR1C3的水平，观察其蛋白水平以及对恩扎卢胺、阿帕他胺治疗敏感性的改变；7）通过免疫共沉淀实验探索AKR1C3蛋白与AR-V7蛋白的相互作用；8）最后，通过AKR1C3、AR-V7的小分子抑制剂对C4-2BMDVR或C4-2BAPALR细胞进行单药或联合给药，并观察肿瘤细胞增殖水平的变化以及对恩扎卢胺、阿帕他胺耐药性的改变。 临床研究部分主要包括以下几方面：1）收集我院1003例前列腺癌患者的前列腺原发灶穿刺标本，进行AKR1C3和AR-V7的免疫组化染色，并分析AKR1C3和AR-V7在不同Gleason评分的前列腺癌患者中的表达情况以及二者之间表达的相关性；2）收集114名在我院接受阿比特龙一线治疗的mCRPC患者的临床病理数据以及前列腺原发灶穿刺标本，并对穿刺标本进行AKR1C3与AR-V7的免疫组化染色；3）使用上述患者穿刺标本中AKR1C3及AR-V7的免疫组化表达情况对患者在阿比特龙治疗中的PSA反应率、PSA无进展生存期、影像学无进展生存期以及总体生存时间进行预后分析。4）在不同的患者亚组中对AKR1C3的预后价值做进一步探索；5）对TCGA-PRAD数据进行挖掘，分析AKR1C3的mRNA水平与M0阶段的前列腺癌患者在手术治疗中的预后的相关性。 结果： 在本课题的基础研究部分，我们通过细胞增殖实验和克隆形成实验证明了对恩扎卢胺耐药的前列腺癌细胞株C4-2BMDVR及CWR22Rv1同样也存在着对阿帕他胺的耐药。对C4-2BMDVR及CWR22Rv1细胞进行WB检测后我们发现，耐药细胞株中的AR-V7和AR-Vs水平明显上升，且不能被恩扎卢胺或阿帕他胺抑制。双荧光素酶报告基因实验的结果同样提示，新一代抗雄药物只能抑制AR引起的雄激素信号通路活化，而不能抑制AR-V7或其他AR突变体引起的雄激素信号通路活化。在使用siRNA干扰或小分子拮抗剂作用于C4-2BMDVR细胞及CWR22Rv1细胞从而抑制肿瘤细胞内AR-V7的活性后，肿瘤细胞对恩扎卢胺的耐药性也发生了逆转。此外，RNA-seq的结果还显示，C4-2BMDVR细胞株相比C4-2BParental细胞株，存在着甾体激素生物合成信号通路相关基因的异常高表达，其中以AKR1C3分子的表达升高最为明显。类似地，使用抑制AKR1C3活性的siRNA干扰或AKR1C3的小分子拮抗剂吲哚美辛作用于C4-2BMDVR细胞后，C4-2BMDVR细胞的耐药性同样也出现了逆转。WB实验的结果显示，AKR1C3的蛋白水平变化会影响肿瘤细胞中AR-V7的蛋白水平，但反之AR-V7则不能对AKR1C3的蛋白水平产生影响。而上调C4-2Bparental细胞中AKR1C3的表达后，肿瘤细胞被诱导随即产生了对恩扎卢胺、阿帕他胺的抗药性，且AR-V7蛋白的水平也随之上升。进一步免疫共沉淀实验的结果也显示，前列腺肿瘤细胞中AKR1C3蛋白可以和AR-V7蛋白结合。上述实验的结果证明了AKR1C3可以通过结合AR-V7，从而对其蛋白水平进行正向调控。另一方面，我们通过细胞增殖实验和克隆形成实验还证明了对阿帕他胺耐药的细胞株C4-2BAPALR也存在着对恩扎卢胺的耐药。RNA-seq的GSEA分析结果也显示，C4-2BAPALR细胞中同样存在着甾体激素生物合成相关基因的上调富集。该结果被qRT-PCR及WB实验验证。类似地，在使用不同方法对C4-2BAPALR细胞中的AKR1C3分子进行抑制后，肿瘤细胞的耐药性也发生了逆转，且细胞中的AR-V7蛋白水平也受到了明显的抑制。使用AKR1C3及AR-V7的小分子拮抗剂联合作用于C4-2BMDVR或C4-2BAPALR细胞相比单药使用能更加明显地对肿瘤的增殖产生抑制效果。 在本课题的临床研究部分，1003例纳入研究的我院前列腺原发灶穿刺标本中，AKR1C3的免疫组化总体阳性率分别276/1003（27.5%）。而AR-V7在初诊阶段的阳性率仅有22/1003（2.2%），提示在激素敏感阶段对AR-V7进行检测临床价值有限。二者的免疫组化阳性率均与前列腺癌Gleason评分正相关。AKR1C3免疫组化阳性表达的前列腺癌患者AR-V7阳性比例显著高于AKR1C3阴性表达的患者（14/276[5.1%]vs.8/727[1.1%]，P＜0.001）。在进入到mCRPC阶段并使用阿比特龙作为一线治疗的114名患者中，CRPC阶段时的前列腺穿刺标本的AKR1C3的免疫组化阳性（阳性率：38/114，33.3%）与否与患者的PSA50反应率无明显关系（20/38[52.6%]vs.49/76[64.5%]；P=0.223）。但值得注意的是，AKR1C3阳性的患者相比AKR1C3阴性的患者拥有更短的中位PSA无进展生存期（5.7月vs.11.2月，P＜0.001）以及影像学无进展生存期（12.4月vs.23.3月，P=0.048）。这一结果在临床病理基线不同的各前列腺癌患者亚组中均得到了较好的验证。另一方面，前列腺原发灶穿刺标本中AR-V7的免疫组化阳性检出（阳性率：11/114，9.6%）却不能有效地预测患者在阿比特龙一线治疗中的预后（PSA无进展生存时间：HR，95%CI：1.47，0.66-3.28，P=0.349；影像学无进展生存时间：HR，95%CI：1.78，0.61-5.23，P=0.294)。我们还对TCGA-PRAD数据库中的444名局限性前列腺癌患者的数据进行了深入的挖掘分析。结果显示，AKR1C3的mRNA水平在高Gleason评分、高T分期、淋巴结(+)的前列腺癌患者中显著高于低Gleason评分、低T分期、淋巴结(-)的患者；前列腺根治标本中AKR1C3的mRNA水平与患者疾病进展时间相关。将所有患者按照AKR1C3的FPKM值的中位数平均分成两组后，低AKR1C3表达组患者的中位无进展生存期较高AKR1C3表达组患者明显更长（115.1月vs.71.0月，P=0.006）。 结论： 1）本研究证实了新一代抗雄药物---恩扎卢胺和阿帕他胺，在治疗去势抵抗性前列腺肿瘤细胞的过程中，具有明确的交叉耐药性；2）基础研究和临床证据均显示AKR1C3对AR-V7蛋白水平有正向调控作用，AKR1C3/AR-V7信号轴的活化是导致前列腺肿瘤细胞产生对上述药物抵抗及交叉耐药的关键因素；3）针对AKR1C3或者AR-V7的小分子拮抗剂可以逆转前列腺肿瘤细胞对恩扎卢胺、阿帕他胺的药物抵抗及交叉耐药；4）TCGA数据库的数据分析结果显示：AKR1C3的mRNA水平与M0阶段前列腺癌患者的高侵袭性特征（如：高Gleason评分、高T分期、淋巴结阳性）相关。AKR1C3的mRNA表达量与局限性前列腺癌患者术后复发进展密切相关；5）对于接受阿比特龙一线治疗的mCRPC患者，前列腺穿刺标本中AKR1C3的蛋白表达预示患者疾病的快速进展及不良预后。
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