摘要
口腔鳞状细胞癌（Oralsquamouscellcarcinoma，OSCC）是口腔颌面部恶性肿瘤中最常见的类型。化疗是OSCC综合治疗的主要方法之一，但是5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）等传统的核苷类化疗药物等溶解性差、生物利用度低、需重复多次给药，而且药物很难选择性地到达肿瘤组织，导致全身毒副作用严重、疗效不佳或无效。相比于传统化疗，局部化疗能够达到增效减毒的目的。水凝胶是一种优异的化疗药物递送载体，具有良好的生物相容性、高效的药物包封能力和灵活的刺激响应性，为OSCC的局部化疗提供了新策略。 目前大多数用于局部化疗的水凝胶系统存在的问题是：药载与药效“分离”，即水凝胶仅作为药物递送的载体，本身无抗肿瘤活性；大多数药物虽有抗肿瘤活性，但本身不能作为载药平台。基于此，课题组在前期的研究工作中，以天然核苷异鸟嘌呤核苷（isoguanosine，isoG）、鸟嘌呤核苷（guanosine，G）和硼酸为原料，成功构建了集药载与药效于一体的异鸟嘌呤核苷-硼酯键-鸟嘌呤核苷（isoguanosine-borate-guanosine，isoGBG）超分子水凝胶。在isoGBG水凝胶系统中，isoG作为活性分子发挥抗肿瘤作用，同时isoG和G在磷酸缓冲盐溶液（phosphatebuffersaline，PBS）中通过多重自组装形成可注射的超分子水凝胶，作为OSCC局部治疗的载体。但是，isoGBG水凝胶存在的问题是无选择性，那么如何提高其选择性呢？查阅文献我们得知，肿瘤微环境（tumormicroenvironment，TME）的pH比正常组织细胞的pH低，肿瘤细胞外的pH值为6.5～7.2。因此，我们设想利用TME的酸性pH来构建一种pH响应性智能水凝胶，以此提高isoGBG水凝胶的选择性。1,4-苯二硼酸（1,4-Phenylenediboronicacid，PBA）与邻二醇反应生成的苯硼酸酯键是一种动态共价键，在pH小于PBA的酸解离常数（aciddissociationconstant，pKa）7.35时，共价键断裂，从而赋予水凝胶精确的TME的酸性pH响应性。 大量的临床前研究已经证实了多种化疗药物在肿瘤细胞系衍生异种移植（cell-derivedxenograft，CDX）模型中的有效性，但是约2/3的药物在临床应用中却无效。因此，需要考虑其他临床前模型来评估药物的有效性和安全性。人源肿瘤异种移植（patient-derivedtumorxenograft，PDX）模型是将病人的肿瘤组织，接种至免疫缺陷小鼠体内建立的临床前肿瘤模型。PDX模型不仅能够保持原始肿瘤的生物学稳定性和肿瘤内的异质性，而且能够再生与患者肿瘤高度相似的TME。基于PDX模型的上述优点，本研究拟使用小鼠OSCCPDX模型来评估所构建的pH响应性水凝胶的体内抗肿瘤活性。 基于前期的研究基础及相关的文献报道，我们的研究假说如下：能否通过引入苯硼酸酯键，构建pH响应性的集药效与药效于一体的双功能核苷水凝胶，其选择性杀死肿瘤细胞，从而实现OSCC的高效治疗。基于我们的研究假说，我们提出如下三个问题：①如何构建pH响应性智能核苷水凝胶？②pH响应性智能核苷水凝胶是否兼具药载、药效及pH响应性的多重功能？③pH响应性智能核苷水凝胶用于OSCCPDX模型的局部治疗效果如何？ 研究目的： 构建一种集药载与药效于一体的pH响应性智能核苷水凝胶，并采用OSCCPDX模型初步探究其体内局部治疗OSCC的效果，以期为OSCC的局部治疗提供新思路、新策略。 研究方法： 1.pH响应性智能核苷水凝胶的构建与表征：首先，以isoG、PBA和G为原料，在不同碱金属离子溶液中利用一锅合成法制备异鸟嘌呤核苷-苯硼酸酯键-鸟嘌呤核苷（isoguanosine-phenylboronic-guanosine,isoGPBG）水凝胶，并通过小瓶倒置实验观察其稳定性，选取稳定性最佳水凝胶进行后续实验。然后，通过1H核磁共振（NuclearMagneticResonance，NMR）、红外光谱（InfraredSpectrometer，IR）、荧光检测等实验技术探究isoGPBG水凝胶的分子交联方式；采用扫描电子显微镜（ScanningElectronMicroscope，TEM）和变温小角衍射（VariableTemperatureSmall-angleX-rayScattering，VTSNXS）等实验技术探究isoGPBG水凝胶的微观形貌结构，为后期提升凝胶性能提供理论指导。 2.pH响应性智能核苷水凝胶的多功能验证：首先，通过流变学实验、注射实验及不同pH条件下的缓释实验，探究isoGPBG水凝胶的机械性能、可注射性及pH响应性，明确其作为药载系统应用的潜能。然后，通过CCK8实验探究isoGPBG水凝胶的体外抗肿瘤活性，初步明确其药效作用，为isoGPBG水凝胶体内应用奠定基础。 3.pH响应性智能核苷水凝胶的体内疗效探究：首先，运用体内降解实验、组织苏木精-伊红（Hematoxylinandeosin，HE）染色，探究isoGPBG水凝胶在体内的降解情况及其生物相容性，进一步阐明该水凝胶在体内的潜在应用价值。然后，构建小鼠人舌鳞癌细胞Cal-27移植瘤模型，初步探究isoGPBG体内局部治疗OSCC的疗效。最后，建立小鼠OSCCPDX模型，进一步探究isoGPBG水凝胶的体内局部治疗效果，为OSCC的局部治疗提供新思路。 研究结果： 1.成功构建了pH响应性核苷水凝胶：①等摩尔比的isoG、PBA和G在PBS中混合，形成具有良好稳定性（室温条件下寿命＞10个月）的isoGPBG水凝胶。②isoGPBG水凝胶中存在动态共价键——苯硼酸酯键和非共价键（氢键作用和π-π堆积）。 2.isoGPBG水凝胶兼具药载、药效与pH响应的多重功能：①isoGPBG水凝胶具有良好的机械性能（储能模量：24851Pa）、可注射性及pH响应性，具有作为药载系统应用的潜能。②isoGPBG水凝胶具有优良的体外抗OSCC细胞增殖活性（对Cal-27细胞的抑制率高达93.26%），兼具药载、药效及pH响应的多重功能。 3.isoGPBG水凝胶抑制OSCC生长且显著改善生存：①isoGPBG水凝胶在体内4天降解，体内可降解特性为其进一步体内应用提供了有利条件。②构建小鼠人舌鳞癌细胞Cal-27移植瘤模型，采用瘤周注射的方法对肿瘤进行局部治疗，与对照组PBS相比，isoGPBG水凝胶的肿瘤抑制率为69.53%。③构建小鼠OSCCPDX模型，采用相同的局部治疗方法，与对照组PBS相比，isoGPBG水凝胶的肿瘤抑制率为45.36%；且治疗结束时，PBS组小鼠的生存率是42.86%，isoGPBG水凝胶治疗组小鼠的生存率是100%。因此，isoGPBG水凝胶不仅可以显著抑制OSCC的生长，还能改善生存，作为一种安全有效的智能超分子水凝胶系统，可为OSCC的局部化疗提供新思路和新策略。 研究结论： 成功构建了一种集药载和药效于一体的pH响应性智能isoGPBG水凝胶，其在小鼠OSCCCDX模型、临床前PDX模型中均显示出潜在的抗肿瘤活性，且能延长生存时间，为OSCC的局部化学治疗提供了新策略。
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