摘要
疾病发生或将要发生时，人体内多个生物学过程将会不同程度的失调，体内的多种生物学分子的含量会发生变化。因而，这些与疾病发生发展相关的生物分子被用于指示生理病理的发生发展。这种可以作为疾病诊断、判断疾病分期以及药物药效评价依据的物质被称为生物标志物。对生物标志物的监控是对疾病早期检测的重要手段。但是存在生物标志物在生物体内早期表达含量低、样本基质复杂等问题，使得临床样本中疾病标志物的含量分析非常困难。现代医学诊断对生物标志物分析方法提出了准确、灵敏的需求。 目前，ELISA是检测蛋白类疾病标志物的经典方法，但是该方法需要反复孵育和洗涤，费力且耗时。同时，结合亲和力抗体会不可避免地受到生物样品中非特异性蛋白的干扰，信号输出组件也很容易被吸附到微孔板上，导致结果的假阳性或假阴性。因此，亟待开发一类更加简单有效的蛋白质疾病标志物传感体系。近年来，基于DNA纳米技术的生物分析策略被越来越多的研究者所关注，并用于检测疾病标志物。利用DNA动态自组装技术，研究者们开发了许多生物分析技术，实现了疾病标志物的临床检测。其中，独特的碱基互补配对以及稳定的氢键作用、独特的分子延展性与灵活性等性质让DNA可以通过设计碱基的序列变化，进而折叠成独特的二级结构甚至三维立体结构，这赋予了核酸分子识别特定目标蛋白质疾病标志物分子的功能，以实现对疾病标志物的识别与检测。另外，借助DNA能够被酶分子重复切割或者被聚合酶分子扩增的优势，DNA介导的信号读出被放大，进而提升其分析方法的灵敏度，来满足临床诊断低浓度标志物的要求。 为了实现疾病标志物的识别及其信号转换，需要通过探针对目标物进行成比例识别及下游信号的变化。识别诱导DNA组装技术（Binding Induced DNA Assembly，BINDA）是一种可以将目标蛋白质分子识别检测转化为对核酸分子检测的生物分析技术。在两条部分互补的单链DNA上分别修饰有蛋白质的识别配体（适配体或抗体）。在目标蛋白的诱导下两条链由于局部浓度增大而互补结合。可以利用此互补结合作用，介导DNA链置换或DNA结构组装等，从而将对蛋白质的识别检测转化为对DNA链置换或DNA结构组装的检测，以便结合后续的信号放大等分析策略。 为放大转换后的DNA信号并最终实现灵敏检测，有关作用于核酸的核酸酶也广泛用于DNA的剪切和聚合。相比于蛋白质类的核酸酶（如内切酶），脱氧核酶（DNAzyme）是一种具有催化活性和结构识别能力的DNA片段，它具有等价的切割活性，并且更为稳定和经济。具体来讲，在金属离子的辅助下，DNAzyme可以特异性识别并切割修饰有RNA碱基的底物DNA链。同时DNAzyme切割底物后又会重新释放，接着与溶液中游离的底物链进行识别结合与催化切割，如此重复多次从而实现信号的放大。同时，借助DNA分子易被修饰的优势，在底物链末端修饰上荧光团与淬灭团来作为信号存储的信标分子。通过催化切割作用调控荧光团与淬灭团的荧光共振能量转移作用，以实现放大的荧光信号输出。 因此，为了满足临床检测灵敏分析的需求，借助识别诱导DNA技术的信号转化作用、DNAzyme催化切割的信号放大作用、以及适配体技术的特异性识别作用的优势，分别构建了两种基于目标物特异性识别诱导DNAzyme释放与激活脱氧核酶信号放大的均相和非均相检测体系： 1.DNA探针分子修饰的适配体或抗体用于识别目标分析物，在目标分析物存在的情况下，探针DNA分子与目标分析物发生识别，并诱导DNA分子发生组装，置换释放原本活性封阻的DNAzyme。接着游离的DNAzyme与底物链发生结合，并在Zn2+的激活下，DNAzyme催化切割底物链，从而导致原本的荧光团和淬灭团分子间的荧光共振能量转移作用被破坏，荧光团的荧光得到恢复并与目标分析物的浓度相关。最后，发夹状的分子信标底物能够被DNAzyme大量切割，并产生放大的荧光信号，从而实现其对低浓度目标分析物的高灵敏检测。利用这样的分析策略，将血小板衍生因子-BB（Platelet derived growth factor-BB，PDGF-BB）适配体与抗前列腺特异性抗原（Prostate specific antigen，PSA）抗体（Anti-PSA）修饰在核酸探针的识别区域，实现了PDGF-BB和PSA的灵敏检测，方法检出限为分别为100pM和200pM。 2.针对复杂基质中（如血清）目标分析物分析，结合了核酸适配体识别技术和磁性分离的优势，构建了基于磁分离微球生物传感平台的核酸适配体结构并实现了对目标物的高特异性识别和高灵敏检测。通过链霉亲和素-生物素作用，在磁珠上修饰带有凝血酶适配体的单链DNA识别探针，在基质溶液中投放另一条包含有凝血酶适配体序列区域和DNAzyme催化区域的单链DNA探针。一旦有凝血酶目标分析物存在，便会在磁珠的表面形成类似三明治结构的适配体-凝血酶-适配体的复合物。其中，携带着DNAzyme催化部位的复合物与脱氧核酶底物链结合，在辅助因子Mg2+的激活下，底物链荧光信标分子被切割，从而产生荧光信号来指示凝血酶分子的含量。利用磁珠易分离洗涤的特点，可以将复杂基质中目标分析物的识别与后续DNAzyme的催化溶液环境的改变。这避免了RNA碱基修饰的底物链在复杂基质中因非特异性降解而导致的假阳性信号的产生，从而能够实现对复杂基质中目标物的检测。 综上，本文通过核酸探针对目标物的识别实现了检测信号的转换，同时通过识别诱导DNA组装和磁分离策略来激活脱氧核酶，实现了检测信号的扩增。因此，针对蛋白质类标志物，分别构建了具有高灵敏度、高特异性和操作简单的均相和非均相检测体系，实现了100pM PDGF-BB、100pM凝血酶和200pM PSA的检测，为床边即时检测提供了新的思路。
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