摘要
2019年底，一种由新型病毒感染引起的病毒性肺炎暴发于湖北省武汉市。紧随其后，全球科研工作者研究并确认此次肺炎源于一种新型冠状病毒。国际病毒分类委员会（ICTV）将此病毒命名为“SARS-CoV-2”（Severe acute respiratory syndrome coronavirus2），又名“2019-nCoV”，此次肺炎命名为COVID-2019[1]。疫情爆发至2021年5月28日，全球214个国家、地区发现确诊病例，累计确诊病例达169,729,600例，死亡病例达3,527,308例。全球疫情形势严峻，迫切需要科研工作者依据新冠病毒的致病机理研究出预防用疫苗、治疗性抗体或者药物，从而缓解并控制此次新型冠状病毒引起的肺炎疫情。 SARS-CoV-2属于冠状病毒科β－冠状病毒属，是具有囊膜的单股正链的RNA病毒，可通过刺突（Spike，S）蛋白的受体结合域（Receptor binding domain，RBD）与人体细胞表面的血管紧张素转换酶2（ACE2）受体结合而感染入侵细胞，从而引起一系列病变[2]。本论文着眼于筛选和验证靶向新型冠状病毒S蛋白RBD功能域的纳米抗体，经由合作生物公司通过噬菌体展示技术筛选得到了21个潜在的靶向RBD的纳米抗体（Nanobody，Nb）基因序列后，首先通过蛋白质纯化技术获得高纯度、高质量的纳米抗体蛋白质，再通过ELISA、细胞流式筛选、假病毒中和实验、表面等离子共振（Surface plasma resonance，SPR）等技术方法，筛选得到具有中和活性和高亲和力的纳米抗体，并在此基础上进一步开展所鉴定纳米抗体与RBD的复合物晶体筛选，以期为后续复合物三维晶体结构的解析进行有效探索。 首先，我们将21个潜在的RBD纳米抗体基因克隆到芽孢杆菌表达载体pNCMO2中，利用芽孢杆菌表达系统进行蛋白表达，再经过亲和层析和分子筛层析纯化方法，成功制备了高纯度、均一性良好的21个纳米抗体蛋白，本论文中将其命名为R1-R21纳米抗体。其次，为了验证上述纳米抗体能否与RBD蛋白结合，我们利用bac-to-bac杆状病毒昆虫细胞蛋白表达系统制备了SARS-CoV-2的RBD蛋白，运用ELISA体外结合实验测定了RBD与21个R纳米抗体的相互作用，结果显示，其中20个R纳米抗体（R1—R20）与RDB蛋白具有强结合，1个R纳米抗体（R21）与RDB蛋白不结合。同时，鉴于重组RBD蛋白中能够暴露的抗原表位，在病毒粒子表面可能会由于S蛋白的三聚化等原因而被遮盖，因此，我们进一步利用流式细胞术，检测了上述21个R纳米抗体与表达于293T细胞表面的全长S蛋白的结合活性。结果表明，共计7个R纳米抗体能够与细胞表面的S蛋白结合，其中3个R纳米抗体（R5、R7、R20）表现出强结合活性，4个R纳米抗体（R14、R15、R16、R19）呈现为中等结合活性；而另外14个抗体不能与293T细胞表面的S蛋白结合。与此同时，我们还利用SARS-CoV-2假病毒，靶向21个R纳米抗体，对其抑制假病毒侵入的活性进行了筛选，发现21个抗体中，5个（R5、R7、R14、R15、R20）呈现出中和活性，其中3个R纳米抗体（R5、R7、R20）表现出强中和活性。针对这3株具有强中和活性的纳米抗体，我们进一步运用SPR技术测定了抗体蛋白与SARS-CoV-2RBD的亲和力，结果显示，R5与RBD的KD值为0.39nM，R7为1.9nM，R20为0.07nM，其结合活性均显著强于ACE2受体（ACE2蛋白与RBD的KD值为85nM）。利用假病毒中和实验，我们进一步测定了这3株中和抗体抑制病毒侵入的半数抑制浓度，结果显示，R5的IC50为1.34μg/mL，R7为1.04μg/mL，R20为0.22μg/mL。最后，为了进一步探究以上3个强中和活性的R纳米抗体结合病毒RBD的分子模式，我们还鉴定并制备了R纳米抗体与SARS-CoV-2RBD的蛋白复合物，并完成了蛋白晶体的初筛工作。截至目前，我们已经成功筛选得到了R20纳米抗体与SARS-CoV-2RBD的复合物晶体，收集到了分辨率为2.0埃的晶体衍射数据，并解析了复合物晶体结构。结构分析显示，R20纳米抗体结合于病毒RBD的外部亚结构域，其识别位点与受体ACE2在病毒RBD中的结合位点高度重叠，表明R20通过竞争和阻断受体的结合而发挥抑制活性。 综上，通过对21个未知活性的、靶向SARS-CoV-2RBD的纳米抗体进行抗体制备、蛋白性质鉴定、与RBD蛋白的体外结合活性研究、与细胞表面S蛋白的结合活性研究以及基于假病毒的中和活性测定，最终筛选得到了3个高效的中和纳米抗体：R5、R7和R20，其结合RBD的能力显著强于受体ACE2，且能够识别表达于细胞表面的S蛋白三聚体，在假病毒中和实验中也呈现出强中和活性。这些研究数据为基于这些纳米抗体的抗新冠病毒治疗药物的研发奠定了基础。
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