摘要
背景及假设：胰腺癌是一种诊断和治疗都非常困难的恶性肿瘤，患者5年生存率小于9%。随着对胰腺癌细胞信号通路的深入研究，已经开发了多种靶标药物，但胰腺癌患者的生存率并没有得到有效提高，提示还存在某些未知的机理。胰腺癌发病过程存在长时间的潜伏期，常见的胰腺癌患者集中在70岁以上。胰腺癌发生的风险因素包括吸烟、遗传因素、肥胖、糖尿病等。吸烟会使患胰腺癌的风险增加75%；约5-10%的胰腺癌患者有家族病史；慢性胰腺炎可以将胰腺癌患病风险提高约3倍；高达80%的胰腺癌患者患有Ⅱ型糖尿病或高血糖。上述风险因素均能引起慢性胰腺损伤，导致胰腺纤维化甚至硬化。胰腺癌以上特点提示我们胰腺组织纤维化及硬化能够促进胰腺癌的发生发展。正常胰腺组织十分柔软，其刚性大约为1.0-1.5kPa，而胰腺癌的恶化总是伴随着胰腺纤维化及硬化，其刚性可达5.0-7.0kPa。因此，我们推测，柔软细胞外基质能够限制胰腺癌发生发展，甚至将发生基因转化的肿瘤细胞限制于细胞休眠状态；而风险因素导致胰腺纤维化及硬化后，该限制机制消失，休眠的肿瘤细胞被唤醒进而快速生长及转移。 研究方法及结果：为模拟柔软的胰腺组织环境，我们将胰腺导管癌细胞包埋在柔软3D细胞外基质中（约0.5kPa）；作为对照，肿瘤细胞被种植在坚硬的2D基质条件或者包埋在高密度3D纤维蛋白中，以模拟组织硬化的界面。以此体外培养方法，本研究探索了柔软细胞外基质环境对肿瘤细胞休眠、细胞内自噬激活、溶酶体生物发生、YAP1蛋白降解的影响。 肿瘤细胞休眠的主要特征是细胞周期被抑制。通过对2D坚硬和3D柔软基质培养后的细胞进行免疫印迹、细胞计数和流式分析，该研究发现3D柔软基质条件下，细胞周期相关蛋白CyclinD1、CDK4显著下调，同时p21上调，细胞增殖速度显著降低，细胞周期被阻滞在G0-G1期。将2D以及3D基质环境下培养后的胰腺癌细胞通过脾脏注射到裸鼠体内，发现在3D柔软基质中处于休眠状态的胰腺癌细胞其成瘤能力以及转移能力显著降低。另一方面，一旦离开柔软基质后肿瘤休眠状态消失。因此，肿瘤细胞休眠需要持续地维持组织环境的柔软性。 通过转录组分析，我们发现3D柔软环境下细胞自噬及溶酶体相关基因表达量普遍升高，提示柔软基质促进细胞自噬及溶酶体的生物发生。柔软3D基质条件下，胰腺癌细胞（KPC961:KrasG12D;Trp53R172H;Pdx1-Cre）其溶酶体的基因表达普遍上调，其中包括多个酸性蛋白酶，溶酶体膜蛋白，溶酶体v-ATPase等等。通过Lysotracker染色、免疫印迹实验，进一步证实了3D条件下细胞内溶酶体发生的增加。以LC3双荧光蛋白为标记，我们发现柔软3D基质条件下细胞内自噬流通增加。 YAP1是肿瘤细胞内机械力信号转导的重要转录因子，能够促进胰腺癌的发生发展。柔软3D基质条件下，胰腺癌细胞内YAP1蛋白能够被快速降解。氯喹造成的溶酶体应激能够抑制YAP1的降解，提示柔软基质激活的自噬溶酶体系统可能参与YAP1的降解。以此，我们用氨基酸饥饿的方法处理细胞激活细胞自噬，发现能够促进YAP1的降解。相反，敲低ATG5、ATG7、p62抑制细胞自噬体的形成能够导致YAP1蛋白积累。 该课题研究了参与YAP1降解的溶酶体关键水解酶。实验发现在3D条件下溶酶体半胱氨酸组织蛋白酶家族表达水平上调，半胱氨酸组织蛋白酶抑制剂E64可以显著阻断YAP1的降解，过表达溶酶体CTSH、CTSL蛋白酶能够促进YAP1降解，通过RNA干预沉默CTSH、CTSL基因的表达也能够阻止YAP1的降解。以上结果表明，在柔软基质条件下细胞内溶酶体半胱氨酸组织蛋白CTSH,CTSL介导了YAP1的降解。 本研究通过生物化学的方法，富集得到YAP1作为底物与CTSL孵育，发现CTSL能够外酸性环境下直接降解YAP1，且体外降解作用也能够被CQ、E64抑制。 本研究也探索了柔软基质是如何加速细胞自噬-溶酶体的流量（flux）。本研究发现在柔软基质中细胞PTEN表达上升并且抑制下游的AKT/mTOR通路，促进自噬-溶酶体降解流量加速，促进YAP1降解。随着细胞外基质密度／硬度的增加，PTEN蛋白下调，导致AKT／mTOR激活，自噬-溶酶体流量减慢。敲低PTEN基因，YAP1蛋白水平上调。以上结果说明PTEN促进3D柔软基质条件下自噬溶酶体激活介导的YAP1的降解。 在临床相关性方面，通过对大量临床样本分析，我们发现溶酶体蛋白LAMP1及CTSL高表达与胰腺癌患者生存期延长有关，提示生理状态的细胞自噬-溶酶体通路可以抑制肿瘤的恶化。 结论及意义：柔软的胞外基质环境中，肿瘤基因转化后的胰腺癌细胞被限制在休眠状态，表现为细胞周期阻滞，细胞体积减小。柔软的胞外基质环境中细胞的溶酶体生物发生增加，PTEN表达上调并且被激活，促进自噬-溶酶体系统的流通，导致半胱氨酸组织蛋白酶介导的YAP1降解。这些发现说明柔软组织微环境能够通过细胞休眠限制胰腺癌细胞的增殖及转移。这些结果在一定程度程度上解释了胰腺癌长时间潜伏期的机制，提示胰腺癌的预防及治疗可着眼于维持组织微环境平衡，避免风险因素导致的胰腺纤维化及硬化，降低肿瘤基质硬度。
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