摘要
背景及目的 作为一种高效低毒的肿瘤局部治疗策略，光动力疗法（Photodynamictherapy，PDT）可控性强、选择性好、安全性高、侵袭性低的优势使其在肿瘤治疗方面极具应用前景。目前已被批准应用于多种类型肿瘤的临床治疗。然而，乏氧的肿瘤微环境、谷胱甘肽相关细胞抗氧化防御机制的存在以及激光穿透深度有限等问题极大限制了光动力疗法的治疗效率，使光动力疗法的临床应用面临巨大挑战。 光动力疗法主要以局部或全身应用光敏剂为基础，在特定的激光照射下，光敏剂吸收光能量从基态跃迁至激发态，继而将多余能量传递给周围氧分子从而产生具有细胞毒作用的活性氧（Reactiveoxygenspecies，ROS）以发挥抗肿瘤治疗作用。ROS的生成效率直接决定了肿瘤光动力治疗效果。肿瘤微环境中氧分子的浓度是影响肿瘤光动力作用过程ROS生成效率的关键因素。然而，肿瘤细胞的异常氧消耗和畸形肿瘤血管常造成肿瘤局部供氧不足，且光动力作用对肿瘤微环境的氧消耗将进一步加剧肿瘤的乏氧程度，这严重降低了光敏剂与氧分子之间能量转化的效率，限制了肿瘤光动力治疗效果。同时，肿瘤细胞还存在谷胱甘肽（Glutathione，GSH）相关细胞抗氧化防御机制，肿瘤细胞内高表达的GSH可有效调节肿瘤细胞内的氧化应激水平，以抵制光动力作用过程产生的ROS对细胞造成的氧化损伤，这对基于ROS的肿瘤光动力治疗是个极大的挑战，使光动力疗法的肿瘤临床治疗效果受限。此外，激光的穿透深度也是光动力疗法应用于深部肿瘤治疗的主要障碍。对于体积过大，或位于组织深部的肿瘤，激光将无法顺利穿透过厚组织达到肿瘤各处，在进入病灶组织前绝大部分光波可能被反射或是与皮肤相互作用而衰退。这使位于肿瘤深部的光敏剂难以产生足够的ROS发挥理想抗肿瘤光动力治疗效果。因此，如何改善乏氧及抗氧化肿瘤微环境，提高ROS的生成效率是目前实现高效肿瘤光动力治疗亟待解决的关键问题，也是当下的科学研究前沿。 近年来，智能响应型纳米递送系统在肿瘤光动力治疗方面的应用极具前景。一方面通过智能响应型纳米递送系统的包载或偶联可以提高光敏剂应用的安全性和可控性；另一方面基于智能响应型纳米递送系统的治疗策略也可弥补一些光动力治疗的不足，通过功能性材料的递送可实现对肿瘤微环境的有效调控，改善肿瘤光动力作用的内在条件，同时还可为光动力治疗策略引入协同性治疗分子，达到协同增效的目的。基于此，在本论文中，我们以开发新型高效的肿瘤光动力治疗策略，提高ROS生成效率，改善肿瘤光动力治疗效果为本论文研究工作的基本目标，构建了基于肿瘤微环境响应型的智能多功能纳米递送系统，以期通过多功能纳米递送系统的应用增强肿瘤光动力治疗效率。我们期望本论文研究工作的开展能够为肿瘤微环境响应型纳米递送系统在优化肿瘤光动力治疗效果方面的应用提供实验依据及理论依据；同时，期望本论文所提出的创新性肿瘤治疗策略能够为克服肿瘤光动力治疗瓶颈问题的相关研究提供新思路和新方法。 主要研究内容及结果 基于肿瘤乏氧和GSH相关细胞抗氧化防御机制对肿瘤光动力治疗的限制问题，在本论文的第一部分，我们设计并合成了一种新型NO供体——硝化甘露聚糖纳米功能材料，并以其为骨架材料，通过注入透析法创新性地构建了肿瘤微环境GSH响应型一氧化氮（Nitricoxide，NO）气体生成纳米平台（Ce6-loadedNO-mannan）。基于硝酸酯键与肿瘤微环境GSH/GSSG的氧化还原反应，我们提出了同时增加肿瘤氧供应及清除GSH的“开源节流”策略，并系统探究了在肿瘤微环境高浓度的GSH的激活作用下，硝化甘露聚糖介导的“开源节流”策略在调节肿瘤乏氧，破坏肿瘤抗氧化防御机制，提高ROS产率及改善肿瘤光动力治疗效果方面的潜力。通过纳米平台的GSH响应性行为评价，ROS产率及NO气体检测试验，我们发现本课题所设计的硝化甘露聚糖骨架材料具有肿瘤微环境GSH相关的氧化还原敏感性，在肿瘤微环境高浓度GSH的还原性反应作用下，Ce6-loadedNO-mannan的硝酸酯结构被破坏，骨架材料的疏水端逐渐被转化为亲水端，纳米粒子结构发生解离。同时，硝化甘露聚糖与细胞内高水平GSH的氧化还原反应，有效实现了细胞内GSH的有效清除和NO气体的响应性释放。硝化甘露聚糖良好的GSH清除能力，有效破坏了细胞抗氧化防御系统，有利于保护光动力作用产生的细胞毒性ROS不被GSH清除。该“节流”策略的应用，有效增加了光动力作用的ROS产率。小鼠体内激光散斑血流成像试验及乏氧肿瘤免疫荧光染色试验结果证明，在肿瘤微环境高浓度GSH的还原性反应作用下，Ce6-loadedNO-mannan具有促使肿瘤局部血管舒张特性，当Ce6-loadedNO-mannan经血液循环到达肿瘤部位后，肿瘤细胞内高表达的GSH可促使其疏水端硝酸酯触发响应性释放NO气体分子，NO气体介导的肿瘤血管舒张作用，能有效增加血流灌注，改善肿瘤血氧供应，有效缓解肿瘤乏氧。该“开源”策略的应用，有效克服了PDT肿瘤乏氧相关的局限性。细胞水平的光动力治疗效果评价试验进一步证明，硝化甘露聚糖骨架材料的引入，极大增加了光敏剂的光动力作用效果，这可能得益于细胞内GSH的有效清除，增加了光动力作用ROS的生成量。此外，纳米平台的体内抗肿瘤效果评价也表明相较于传统光动力疗法，本课题所提出的“开源节流”肿瘤光动力治疗策略具有更优越的抗肿瘤治疗效果。 ROS的生成效率直接决定了肿瘤光动力治疗效果，为了进一步解决激光穿透深度不足对基于ROS的光动力治疗的限制问题，在本论文的第二部分，我们从药剂学角度出发，以人血清白蛋白作为纳米反应器的骨架，根据生物矿化机理，引入了内源性驱动力产生ROS的治疗剂——过氧化铜纳米材料，构建了基于过氧化铜的肿瘤pH响应型自催化纳米反应器（HSA-Ce6-CuO2），使其在外部光源能量供给不足或穿透效率低的情况下，通过化学动力学疗法（Chemodynamictherapy，CDT）从肿瘤内部驱动ROS的产生，以弥补激光穿透深度不足时光动力作用ROS生成效率低的问题，实现外部能量触发的PDT治疗与内部环境驱动的CDT疗法的有机结合。同时，基于过氧化铜纳米材料在肿瘤微环境弱酸性条件下自产“H2O2/O2”性能，我们提出了PDT治疗与CDT治疗反应底物自供应的“H2O2/O2自给自足”策略，并系统探究了在肿瘤微环境低pH条件的激活作用下，过氧化铜纳米材料介导的内部环境驱动的CDT作用及“H2O2/O2自给自足”策略在多途径产生ROS，改善肿瘤氧底物（H2O2/O2）供给，提高基于ROS的抗肿瘤治疗效果方面的潜力。通过对不同pH条件下HSA-Ce6-CuO2生成H2O2的能力，释放Cu2+的能力，生成?OH及生成O2的能力进行系列评价，我们证明我们所构建的自催化纳米反应器在肿瘤微环境酸性条件下具有优越的CDT作用潜力及H2O2/O2自给自足功能。在pH5.5的酸性条件下，HSA-Ce6-CuO2能够响应性地释放Cu2+和H2O2，释放的Cu2+进一步与H2O2进行类Fenton反应，产生细胞毒作用最强的一类活性氧——羟基自由基（Hydroxylradical，?OH），从而实现内部环境驱动的CDT治疗。同时，酸性条件下H2O2的产生将增加肿瘤微环境的H2O2浓度，该“H2O2自给”策略能进一步增加CDT作用氧底物，提高CDT作用效率。此外，在Cu2+的催化作用下H2O2还能够进一步转化为O2，纳米反应器的“自产O2”能力，可有效缓解肿瘤乏氧，增加PDT作用反应底物，提高氧依赖性治疗方式PDT的疗效。总ROS生成能力评价及细胞水平PDT/CDT联合治疗效果评价进一步证明将外部激光能量触发的PDT治疗与内部酸性环境驱动的CDT治疗相结合的治疗策略，能有效增加ROS生成效率，达到多重抗肿瘤治疗效果目的。小鼠肿瘤光声成像试验，小鼠肿瘤乏氧免疫荧光染色试验再次证明了HSA-Ce6-CuO2可通过在酸性肿瘤微环境响应性释放O2，缓解肿瘤乏氧。最后动物水平HSA-Ce6-CuO2的PDT/CDT联合治疗效果评价也验证了：相较于单独的PDT治疗组或CDT治疗组，本课题所提出的将外部能量触发的PDT治疗与内部环境驱动的CDT治疗相结合及“H2O2/O2自给自足”策略能显著提高基于ROS的抗肿瘤治疗效率。 结论 本论文对肿瘤微环境响应型多功能纳米递送系统的构建及其在增强肿瘤光动力治疗效果方面的应用作了系统研究。研究发现，GSH响应型一氧化氮气体生成纳米平台的应用能够通过同时增加肿瘤氧供应及清除GSH的“开源节流”策略有效调节乏氧肿瘤微环境并破坏肿瘤抗氧化防御机制，有利于提高氧依赖性PDT治疗方法的ROS产率；肿瘤pH响应型自催化纳米反应器的应用能够将外部能量触发的PDT治疗与内部酸性环境驱动的CDT治疗有机结合，该策略的应用有效增加了ROS的生成效率，达到了多重抗肿瘤治疗效果目的。此外，酸响应性自给氧及自给过氧化氢策略的应用可为基于?OH的CDT治疗及基于单线态氧的PDT治疗提供足够的氧底物，进一步放大PDT和CDT的肿瘤杀伤作用，更高效地提高基于ROS的PDT/CDT抗肿瘤治疗效率。本论文的研究为解决肿瘤光动力治疗的几大瓶颈问题提供了简单而高效的方法，拓展了肿瘤光动力研究的思路和途径。同时，也为其他新型抗肿瘤治疗策略的开发和设计注入了新思考。
NETL