摘要
目的： 骨关节炎（OA）以膝关节疼痛、软骨破坏和骨赘形成为显著特征，是临床上最常见的关节炎。OA是累及整个关节的复杂的慢性关节炎，基质金属蛋白酶（MMP）激活后，软骨、软骨下骨和滑膜都参与了OA的发病过程，其中滑膜炎是OA发病的关键因素之一。巨噬细胞和成纤维细胞样滑膜细胞是滑膜细胞的两种主要亚型。巨噬细胞可以被激活和极化，在不同的微环境可以迅速完成表型转换。M1型巨噬细胞可以分泌大量的促炎细胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS等，而M2型巨噬细胞维持其抗炎活性，并释放IL-10等抗炎因子。OA患者受累关节存在着巨噬细胞异常极化的现象，研究证明巨噬细胞极化在OA的发生和发展中都起着重要作用。多种信号通路调节了巨噬细胞的分化，然而具体的机制还未完全阐明。 尿源干细胞（USC）具有易获取、安全无创、成本低、运输和储存简便、无免疫排斥风险等特征。而且USC的端粒更长、端粒酶活性更高，比其他来源的MSC优势明显，具有更广阔的市场前景。微粒（MV）具有抑制炎症因子释放、调控炎症发生的能力。MSC-MV能够下调血清中TNF-α、IL-6、IFN-γ等炎症因子的水平，同时上调抗炎因子IL-10。相关的基础研究及临床研究都证实了MSC治疗OA的确切疗效。但是关于USC来源的MV能否通过调节巨噬细胞的极化来治疗OA尚未见报道。本课题基于目前的理论背景和课题组前期的研究基础，我们提出了“USC-MV调控M1/M2巨噬细胞分化治疗OA”的课题假说，采用体内和体外实验的方式，运用多种检测手段探索其作用效果及相关机制，为OA的MSC及细胞外囊泡（EV）治疗提供证据支持。进一步探索EV在OA中对巨噬细胞极化的作用机制，可为寻求预防OA发展的有效策略提供新的思路，也为实现自体USC-MV治疗OA的临床转化提供依据。 材料和方法： 采用多次离心的方法从健康成年人的清洁中段尿液中分离提取了USC，建立了体外稳定扩增的培养体系；显微镜下观察细胞形态，绘制细胞增殖曲线；MSC和USC的体外成骨、成脂和成软骨分化能力分别采用茜素红、油红O染色和阿利新兰染色/番红O染色鉴定；流式细胞术（FCM）鉴定了USC和MSC的表面抗原；无血清培养48h后采用差速离心的方法提取了USC和MSC培养上清中的MV；NanoDrop测定MV蛋白质浓度；NTA测定粒径及粒子浓度；透射电镜（TEM）观察MV的超微结构；WB鉴定MV标志蛋白。 采用改良Hulth法手术构建了家兔双膝OA模型，30只雄性家兔随机分为Sham组、PBS组、MSC-MV组、USC-MV组和USC组共五组，每组6只。造模成功后，每周一次关节腔注射给药，共3次。①Sham组：安慰手术+关节腔注射100μLPBS溶液；②PBS组：改良Hulth法OA手术+关节腔注射100μLPBS溶液；③MSC-MV组：改良Hulth法OA手术+关节腔注射100μL（0.12mg）UC-MSC-MV悬液；④USC-MV组：改良Hulth法OA手术+关节腔注射100μL（0.12mg）USC-MV悬液；⑤USC组：改良Hulth法OA手术+关节腔注射100μLUSC细胞悬液（2.0×106cells）。第3次给药后一周安乐死家兔，并留取外周血、关节灌洗液、尿液及膝关节标本。使用无Indiaink染色的关节软骨宏观变化评分系统对家兔的膝关节肉眼观进行评分；采用microCT检查左膝关节，采用锥形束扫描重建关节的三维图像后对各组关节进行K-L分级；CaliperAnalyze软件对MicroCT结果进行了定量分析，扫描了干骺端以上50层的区域，计算BV/TV，BS/TV，BS/BV，Tb.Th，Tb.N，Tb.Sp等数据并分析；ELISA检测血清和关节灌洗液中的IL-1β和TNF-α水平，以及血清和尿液中的骨、软骨代谢物水平；qPCR检测右膝关节软骨炎症因子、MMP及巨噬细胞极化相关基因表达水平；HE染色评估关节软骨滑膜炎症细胞浸润；MRC-1免疫组化染色评估关节M2巨噬细胞表达；番红O固绿和甲苯胺蓝染色后，采用Mankin系统和OACH评分系统评价关节软骨破坏。 形态学、FCM和qPCR的方法检测USC-MV和MSC-MV对THP-1源巨噬细胞分化的影响；共聚焦显微镜验证巨噬细胞内化MV的能力；CCK8检测USC-MV和MSC-MV对细胞增殖能力的影响；细胞划痕实验检测USC-MV和MSC-MV对于M0、M1、M2巨噬细胞迁移能力的影响。 酶消化法建立了软骨细胞系；WB检测信号通路蛋白；Transwell共培养软骨细胞和巨噬细胞，使用IL-1β刺激模拟OA关节内的炎症状态，qPCR检测炎症状态下MV的免疫调节作用。 结果： 原代USC培养3~7天后即可贴壁，观察到USC存在谷粒型、丝连型和梭型等三种形态。原代USC增殖较慢，传代后增殖速度明显增快，多次传代后细胞形态稳定。USC和MSC可在体外分化成脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞，表达CD73，CD90和CD105抗原，不表达CD11b，CD14，CD34，CD45，CD19，CD79a或HLA-DR等。透射电镜下MSC-MV和USC-MV表现为茶托状的一侧凹陷型囊泡，大小均匀，直径在100~300nm之间。而且USC-MV与MSC-MV均可表达经典的外泌体标记anti-CD9，anti-FLOT1和anti-TSG101蛋白。 成功构建了OA家兔模型。肉眼观察可见PBS组较Sham组关节面粗糙，软骨面严重纤维化，色泽灰暗。软骨面明显变薄，局部有软骨下骨暴露。经MSC-MV，USC-MV及USC治疗后，软骨较PBS组明显增厚，关节面光滑完整，呈现乳白色，三个治疗组关节面的软骨破坏都得到了不同程度的改善及修复，治疗后OA宏观评分降低，差异有统计学意义，USC-MV的治疗效果与MSC-MV及USC无明显差异。 MicroCT检查结果示Sham组膝关节基本正常，关节表面光滑，关节间隙均匀一致，无明显的关节狭窄，无明显骨赘形成及关节畸形。PBS组可见明显关节狭窄，软骨面粗糙、变薄，间隙不对称，软骨下骨存在骨质疏松，囊性变，骨板周围有岛状骨痂形成。经MSC-MV，USC-MV及USC治疗后，关节面软骨略有增厚，胫骨平台变光滑，骨小梁密度增加，骨质疏松也存在不同程度的改善。K-L分级评分提示MSC-MV、USC-MV及USC治疗均有效，其中USC-MV组降低K-L评分最显著。分析各组的骨量参数和骨小梁结构参数发现，PBS组较Sham组的Tb.N和Tb.Th数值降低，Tb.Sp数值升高，经MSC-MV、USC-MV及USC治疗后Tb.N和Tb.Th数值略有升高，Tb.Sp数值有降低，但除了MSC-MV组外，差异均无统计学意义。 ELISA结果提示，PBS组尿液中的CTXⅠ和CTXⅡ水平较Sham组明显升高，USC-MV可显著下调尿液中的CTXⅠ和CTXⅡ水平，MSC-MV可降低尿液中的CTXⅠ水平，差异有统计学意义。PBS组尿液中的P1NP浓度较Sham组降低，三种治疗均可使PINP水平回升，其中USC优于MSC-MV，优于USC-MV，但只有USC治疗组与PBS模型组间的尿液P1NP水平差异具有统计学意义。但是血清中的CTXⅠ、CTXⅡ和P1NP在各组中未发现一致的趋势。PBS组的血清IL-1β和TNF-α水平均高于Sham组，差异有统计学意义，经过MSC-MV、USC-MV和USC治疗后，炎症因子水平下降，但是只有血清IL-1β经过MV治疗后的变化具有统计学差异。在关节灌洗液中观察到了相似的趋势，但是差异无统计学意义。 qPCR结果提示PBS组的IL-1β、TNF-α等炎症因子较Sham组表达升高，在治疗后降低，但是只有USC治疗组下调IL-1β的作用有统计学意义。我们还观察到PBS组TGF-β水平下降，治疗后也有升高，USC的作用优于MV组。我们还检测了关节软骨中的MMP-13和MMP-9水平，发现PBS组较Sham组表达水平明显升高，USC-MV、MSC-MV及USC治疗均可下调MMP-13和MMP-9水平，差异有统计学意义。qPCR检测关节软骨中巨噬细胞的极化状态，结果提示PBS组M1巨噬细胞标志物IL-6表达水平较Sham组显著升高，经过USC-MV和MSC-MV治疗后显著下调。MSC-MV还可显著上调M2巨噬细胞标志物MRC-1的水平。说明PBS组较Sham组出现了显著的M1极化，治疗后呈现向M2极化的趋势。 采用改良番红O-固绿染色、甲苯胺蓝、HE染色的方法对各组的左膝关节切片进行染色，Sham组染色后可见软骨面光滑完整，软骨各层结构清楚，有完整的潮线，软骨着色均匀一致，软骨下骨结构正常，骨小梁均匀。PBS组可见软骨表面不平整，软骨基质着色浅淡，软骨表面出现垂直于骨面的裂隙，深达软骨全层，潮线缺损甚至消失，部分表层关节软骨坏死、脱落，残余软骨细胞呈现绒毛状，严重的区域软骨层消失，骨面暴露。MSC-MV组可见软骨表面不光滑，表层软骨出现纤维化，染色异常，可见浅表溃疡及软骨层撕裂。表层软骨细胞形态异常，出现细胞肥大及细胞坏死。软骨层变薄，潮线紊乱，新生血管自软骨下骨长入软骨层。USC-MV组可见软骨表面不平整，表层软骨出现龟裂，染色异常。表面伴随有新生软骨簇形成，呈不规则状或球形的团块。软骨各层排列比较整齐，潮线前移。USC组整体软骨厚度尚可，染色均匀。表面软骨层欠光滑，软骨浅层和移行层可见浅裂隙形成，可见新生血管长入软骨深层。MSC-MV、USC-MV及USC治疗可显著降低OACH评分和Mankin评分，差异有统计学意义。且MSC-MV治疗效果优于USC，优于USC-MV。 HE染色评估关节滑膜的炎症浸润，可见Sham组的滑膜为2~3层细胞，贴附在骨软骨交界处，周围是疏松结缔组织，未发现明显的单个核细胞浸润。PBS组可见受损软骨附近的滑膜增厚、充血，有绒毛形成，间质内可见大量炎症细胞。MSC-MV组、USC-MV组和USC组治疗可明显减少炎症细胞浸润及滑膜充血水肿。 免疫组化结果示MRC-1阳性表达于软骨细胞的细胞膜和细胞质内，镜下表现为棕黄色或棕褐色颗粒沉积。PBS组的MRC-1主要表达在软骨表层，沿软骨边缘呈线状沉积。PBS组软骨损毁严重，MRC-1零散的沉积在残存软骨边缘。三个治疗组MSC-MV组、USC-MV组和USC组的MRC-1表达明显增加，分布在软骨浅层、中层及软骨表面及裂隙边缘。 THP-1细胞镜下呈大小均一的球形悬浮细胞，100ng/mLPMA刺激48h可诱导THP-1细胞分化成为贴壁的M0巨噬细胞，形态变扁平。洗去未贴壁的细胞，100ng/mLLPS和20ng/mL的IFN-γ继续刺激24h可使细胞向M1分化，镜下可见细胞有较多突起，呈细长的梭型，FCM示大于50%的细胞CD80阳性，表明成功分化成M1型巨噬细胞，20ng/mLIL-4和20ng/mL的IL-13可诱导细胞分化成多角形或类圆形的M2型巨噬细胞。qPCR的方法验证巨噬细胞极化相关基因mRNA水平的表达，约在6h时大部分M1和M2极化基因表达明显升高，部分可达峰值。qPCR结果示诱导巨噬细胞向M1极化后，M1相关基因CD80，iNOS，IL-12P40，IL-6等基因的表达较刺激前明显升高，IL-1β，TNF-α，COX-2，NF-κB等炎症相关基因表达也明显升高。M2相关基因CD206，Fizz-1，DC-Sign等在诱导M2极化后表达水平明显升高。 用荧光染料PKH26染色MV，与CFSE染色的巨噬细胞共孵育3小时，经CFSE处理的巨噬细胞呈现绿色荧光，EV经PKH67染色后呈现红色荧光。未与EV共培养的巨噬细胞未发现红色荧光，对于添加了MSC-EV和USC-EV的巨噬细胞，在胞内可发现红色荧光。 CCK8结果提示，在1*103~1*1010/mL的MSC-EV或USC-EV浓度区间内，与未处理的细胞相比，THP-1细胞的增殖速率随MV的浓度升高而增加。在5*108~2*109/mL的MV浓度区间内，与未处理的细胞相比，RAW264.7细胞的增殖速率随MV的浓度升高而增加。 显微镜下可见，M0细胞在加入MSC-MV或USC-MV处理24h后，细胞出现了较多突起，细胞形态呈多角形，细胞内出现了棕色颗粒，表现为M2巨噬细胞的特点。当加入LPS和IFN-γ刺激后细胞伸出伪足，变为细长或扁长的梭型，表现出M1型巨噬细胞的特点。当M0与MSC-MV或USC-MV共孵育1h后再加入LPS和IFN-γ刺激时，24h后同时出现了梭型细胞与多角形细胞。 qPCR结果提示，不同浓度的MSC-EV或USC-EV预处理可以阻断M1极化过程，使M2极化相关基因CD206、Arginase-1、LOX-1和IL-10等表达上调。其中109/mL和1010/mL浓度的MSC-MV，107/mL、108/mL和109/mL浓度的USC-MV作用最佳。划痕实验结果提示，与未加MV组相比，1*109/mL浓度的USC-MV和MSC-MV均能促进M0、M1和M2细胞的迁移，且USC-MV优于MSC-MV。 成功培养出原代软骨细胞，贴壁后细胞呈多角形，随传代次数增加，细胞逐渐变为长梭形。使用阿利新兰染色和番红O染色的方法进行鉴定。利用Transwell将M0或M1巨噬细胞与加或不加10ng/mL的IL-1β的软骨细胞共培养，结果提示加入IL-1β刺激后，软骨细胞分泌IL-1β、TNF-α、MMP-13和IL-6水平增加，IL-10水平下降，在加入2*109/mL浓度的USC-MV和MSC-MV的培养体系中，上述炎症因子水平变化可被逆转。 WB检测PI3K-Akt-mTOR及NF-κB通路蛋白，结果示M1极化状态时NF-κB通路活化，P65蛋白发生磷酸化，MSC-EV和USC-EV均可通过抑制P65蛋白的磷酸化下调NF-κB通路，且具有浓度依赖性。M2极化状态时Akt通路活化，Akt发生磷酸化，MSC-EV和USC-EV均可通过上调Akt的磷酸化活化P-Akt通路，且具有浓度依赖性。但是对PI3K和mTOR通路蛋白的表达及磷酸化并无明显调控作用。 结论： 1、健康成年人的清洁中段尿液中可分离提取出USC，并在体外稳定扩增，表达干细胞的表面标志并具有多向分化潜能。USC-MV和MSC-MV表现为茶托状的囊泡，大小均匀，直径在100~300nm之间，表达经典的外泌体标记。 2、MSC-MV，USC-MV及USC治疗可降低OA血清炎症水平，同时调节软骨代谢及骨代谢，减轻和修复关节面的软骨破坏，缓解滑膜炎症，同时降低OACH评分和Mankin评分。OA关节软骨中巨噬细胞呈现M1极化趋势，在治疗后可向M2极化。 3、巨噬细胞可成功内化MV。向M1极化后，M1相关基因CD80，iNOS，IL-12P40，IL-6等表达升高，IL-1β，TNF-α，COX-2，NF-κB等炎症相关基因表达也明显升高。M2极化后，M2相关基因CD206，Fizz-1，DC-Sign表达水平也明显升高。 4、MSC-EV和USC-EV可在体外促进巨噬细胞的增殖、迁移，可阻断LPS和IFN-γ诱导的M1极化，并使巨噬细胞向M2极化。 5、MSC-EV和USC-EV可能是通过上调Akt的磷酸化，活化PI3K-Akt-mTOR通路，和（或）阻断P65蛋白发生磷酸化抑制NF-κB通路活化，从而阻断M1极化过程，使巨噬细胞向M2极化。 6、我们使用Transwell系统共培养了软骨细胞和巨噬细胞，使用IL-1β刺激模拟OA关节内的炎症状态下的软骨细胞，发现USC-MV和MSC-MV可以下调IL-1β活化的软骨细胞分泌的炎症因子水平，表明MV在炎症微环境中仍能正常发挥抑炎作用。
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