摘要
铁离子作为自然界最为丰富的微量元素参与了细胞重要的生命过程，在肿瘤细胞中为满足肿瘤细胞快速生长的需要，肿瘤细胞中铁离子含量增加。当细胞内的铁离子浓度超过一定的阈值，大量的铁离子会通过Fenton反应产生脂质过氧化物和活性氧，攻击细胞内的生物大分子，导致肿瘤细胞死亡。 2012年报道了一种名为铁死亡(Ferroptosis)的新型细胞死亡形式，其显著特征表现为细胞内铁离子浓度升高和活性氧的堆积。铁离子浓度升高是铁死亡最重要的特征，转铁蛋白受体1(Transferrinreceptor1,TFR1)作为铁离子的门控蛋白，严格控制着铁离子进入细胞。研究发现TFR1在多种肿瘤细胞中均存在高表达现象，预示着TFR1在肿瘤细胞铁代谢中的重要作用。随着对TFR1在肿瘤细胞中作用的深入研究，其翻译后修饰逐渐引起人们的关注。泛素化是一种常见的蛋白质翻译后修饰方式，通过影响蛋白的丰度和活性来影响细胞生命进程。研究表明TFR1存在泛素化修饰，但TFR1及其泛素化修饰对铁死亡的影响仍然不清楚。本论文对TFR1的泛素化修饰与铁死亡之间的关系进行了初步探究，以期为TFR1的泛素化修饰影响铁死亡的分子机制研究提供参考。 本论文首先用生物信息学方法分析了铁死亡差异基因参与的信号通路和分子功能，以及铁代谢基因在肝癌和癌旁组织中的表达，确定在铁死亡和铁代谢过程中都发挥重要作用的基因。然后用铁死亡诱导剂Erastin处理肝癌细胞HepG2后，检测铁死亡标志性指标，以验证铁死亡模型是否构建成功；利用QPCR、WesternBlot检测铁代谢相关蛋白的mRNA和蛋白表达水平；最后，以TFR1为研究对象检测铁死亡细胞中TFR1的稳定性以及其泛素化情况，利用质谱鉴定出TFR1的泛素化位点后将其泛素化位点突变，检测TFR1泛素化位点突变对其蛋白稳定性以及对铁死亡的影响。 本研究利用生物信息学方法发现ACO1、STEAP3和TFR1在铁死亡和铁代谢过程均起着重要作用，并且STEAP3和TFR1在肝癌组织中的表达显著高于癌旁组织。利用铁死亡诱导剂Erastin处理HepG2细胞后，细胞内脂质ROS含量升高、铁离子含量升高、细胞形态发生明显变化，当Erastin与铁死亡抑制剂或铁螯合剂共处理时，能够避免细胞死亡，表明Erastin诱导的细胞死亡类型为铁死亡。为检测细胞铁死亡后的铁代谢水平，本课题检测了铁代谢相关蛋白的表达水平，结果显示TFR1蛋白升高最为显著。进一步检测发现TFR1蛋白在铁死亡状态下稳定性增加、泛素化程度降低，经质谱鉴定，发现Erastin诱导HepG2细胞铁死亡后TFR1Lys665泛素化修饰发生改变。将Lys665泛素化位点突变后，TFR1蛋白稳定性增加，泛素化水平降低，HepG2细胞对铁死亡诱导剂Erastin敏感性显著增加。 综上，本研究发现在Erastin诱导HepG2细胞后，TFR1蛋白Lys665泛素化修饰改变导致其蛋白量积累，并且通过向细胞内转运进入大量的铁离子进而造成HepG2细胞铁死亡。
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