摘要
根尖周炎是口腔最常见的感染性疾病之一，由牙髓病原体引起根尖区炎症和根周组织破坏。根尖周炎的病程进展和转归取决于根管微生物与宿主防御之间的动态平衡。当致病因素能被消除时，根尖炎症不会引起骨质破坏和吸收；但当致病因素不能被消除时，则会介导根尖区骨质吸收和组织破坏。虽然已有较多关于根尖周炎发生发展的研究，但参与其中的多种分子机制尚未研究透彻。 近年来，一种由受体相互作用蛋白激酶1（receptorinteractingproteinkinase-1，RIP1）、受体相互作用蛋白激酶3（receptorinteractingproteinkinase-3，RIP3）和混合系谱激酶结构域样蛋白mixedlineagekinaselike，MLKL）介导的细胞死亡方式，即程序性细胞坏死被广泛研究。它是近年来新发现的一种细胞调控性死亡，该方式致使细胞破坏是通过形成死亡小体。程序性细胞坏死参与了许多炎症疾病如回肠炎、皮肤炎症、系统性炎症反应综合症的发生发展，能被肿瘤坏死因子α（tumornecrosisfactorα，TNF-α）、细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、细胞膜上的Toll样受体（Toll-likereceptors，TLRs）等分子介导激活，而上述分子也与根尖周炎的发生发展密切相关，这提示了二者之间的潜在联系。然而根尖周炎的发生发展是否有程序性细胞坏死的参与，并未见文献报道。 目的：通过体内体外实验，探索程序性细胞坏死在根尖周炎发生发展中的作用，从而揭示根尖周炎潜在的致病机制，以期为根尖周炎的防治提供新的策略。 方法：1.利用髓腔定植根尖周炎致病菌--具核梭杆菌（Fusobacteriumnucleatum，Fn）的方法构建根尖周炎小鼠疾病模型。通过微计算机断层扫描（Micro-computedtomography，Micro-CT）、苏木精-伊红染色（Hematoxylin-eosin,HE）以及破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶染色（Enzymeactivitystainingoftartrate-resistantacidphosphatase，TRAP）对根尖周病损区进行硬组织形态学分析和骨吸收进行评估。利用免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）染色检测程序性细胞坏死通路中关键分子RIP3和磷酸化MLKL（Phosphorylatedmixedlineagekinaselike,pMLKL）的表达情况。 2.体外培养L929小鼠成纤维细胞系，通过Fn模拟炎症刺激，并给予TNF-α、凋亡抑制蛋白抑制剂-AZD5582和酪蛋白酶抑制剂-zVAD-FMK共同处理诱导L929程序性细胞坏死，采用蛋白免疫印迹法（WesternBlotting，WB）、免疫荧光（Immunofluorescence，IF）、定量逆转录聚合酶链式反应（QuantitativeReal-TimePCR，qRT-PCR）和细胞坏死活力检测试验，检测Fn对L929的刺激作用。 3.构建根尖周炎小鼠疾病模型，使用腺病毒相关病毒（Adenovirusassociatedvirus，AAV）抑制程序性细胞坏死关键分子RIP3的表达。成纤维细胞系L929和Fn共培养，小干扰RNA（SmallinterferingRNA；siRNA）转染抑制RIP3的表达。通过Micro-CT及TRAP染色对根尖周病损区进行硬组织形态学分析，对各组骨吸收进行评估。通过WB、IHC染色及qRT-PCR对各组根尖周区域的RIP3和pMLKL的表达和下游炎性细胞因子进行检测，探究根尖周炎中程序性细胞坏死的作用。 结果：1.根尖周炎疾病模型中，骨吸收和破骨细胞数量随时间而增加，程序性细胞坏死通路关键分子pMLKL表达升高。 2.在成纤维细胞中，Fn刺激可以上调程序性细胞坏死通路中关键分子RIP3、pRIP3、MLKL、pMLKL的表达和炎症基因mRNA表达水平，并可以加剧细胞坏死降低细胞活性。 3.在成纤维细胞中抑制RIP3后，pMLKL表达降低，细胞活力增强，坏死减少，相关炎症因子基因的mRNA表达水平降低；根尖周炎疾病模型中，抑制RIP3蛋白表达后，pMLKL表达降低，破骨细胞数量减少，根尖区骨质吸收减少，炎症基因mRNA表达水平降低。 结论：在受Fn刺激的L929细胞和小鼠根尖周炎模型中，程序性细胞坏死通路被激活，炎症表型加剧；抑制程序性细胞坏死通路中的RIP3之后，其关键执行分子pMLKL表达水平降低，破骨细胞数量和相关炎症因子基因mRNA表达水平降低，小鼠根尖周炎骨吸收减少，表明程序性细胞坏死参与了根尖周炎的致病过程。
NETL