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Kappa阿片受体激动剂对急性肺损伤的作用及机制研究

曾思
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Kappa阿片受体激动剂对急性肺损伤的作用及机制研究

曾思1
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  • 1. 四川大学
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摘要

目的： 严重感染和创伤患者极易出现急性肺损伤（Acutelunginjury，ALI），它已成为危重症患者最常见致死病因。ALI患者肺部出现失控炎症反应和血管通透性增加，最终可导致多器官功能衰竭甚至死亡。尽管近年来随着ALI救治技术的发展，ALI患者使用抗炎治疗药物后得到了改善，然而这些促进炎症介质消退的药物在体内半衰期短、不稳定。目前尚缺乏治疗ALI的有效药物或临床策略。因此，探索治疗ALI的新药和治疗靶点成为临床亟待解决的重要难题。 最常见的ALI致病菌有革兰氏阳性菌种和革兰氏阴性菌种等。在革兰氏阳性菌种中，金黄色葡萄球菌（S.aureus）是ALI的最主要致病原因，特别是耐抗生素菌株，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistantS.aureus，MRSA）出现，导致世界范围内ALI一直呈高发病率和死亡率的态势。此外，革兰氏阴性菌所致ALI，其主要致病成分脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS），可诱导细胞产生过量致炎介质。因此，探索不同致病菌所致的ALI和研发ALI治疗中新的抗炎靶点及机制，是国内外学者聚焦的前沿热点。 阿片类药物已广泛应用于围手术期和危重症患者，然而对其在肺免疫功能和炎症反应中的作用却知之甚少。Kappa阿片受体（Kappaopioidreceptor，KOR）激动剂有很强的镇痛、镇静作用，最新研究发现：新型KOR激动剂SalvinorinA（SA）对免疫功能的调节也起重要作用，但新型KOR激动剂SA能否抑制ALI肺部失控的炎症反应及具体机制尚不清楚。本课题研究的主要目标是观察新型高选择性非阿片类KOR激动剂SalvinorinA（SA）对革兰氏阳性菌种和革兰氏阴性菌种所致ALI的保护作用及阐明其分子机制。 本研究首先建立革兰氏阳性菌MRSA所致ALI小鼠动物模型，观察KOR激动剂SA的肺保护作用及对转录因子核因子E2相关因子2（Nuclearfactorerythroid2-relatedfactor2，Nrf2）通路的影响；利用Nrf2基因全身性敲除小鼠明确Nrf2通路介导SA对MRSA所致ALI小鼠肺保护的作用机制；在MRSA主要致病成分脂磷壁酸（Lipoteichoicacid，LTA）诱导的巨噬细胞细胞模型上，深入探讨Nrf2mRNA和蛋白水平，及其下游基因HO-1、Gclm、Txn、SOD1和SOD2的表达。此外，使用革兰氏阴性菌致病成分LPS诱导肺泡巨噬细胞活化，应用KOR激动剂SA和U50488，并用KOR拮抗剂Nor-Bin，进一步验证KOR激动剂对肺巨噬细胞炎症反应的抑制作用，本研究拟明确KOR激动剂SA对ALI的保护作用及抑制肺泡巨噬细胞释放炎症因子的作用，探讨SA肺保护的分子机制，为临床使用SA治疗ALI患者提供理论基础。 材料和方法： 第一章Kappa阿片受体激动剂SA对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌诱导小鼠ALI的作用研究 利用MRSA气道滴注构建ALI小鼠动物模型，并给予KOR激动剂SA（50μg/kg）治疗。通过观察肺组织形态、肺损伤评分、肺泡灌洗液中蛋白浓度和细胞计数、肺组织MPO免疫组化染色和活性测定、肺组织炎症因子（TNF-α，IL-1β、IL-6、Nrf2、HO-1和SOD1）的mRNA表达情况、外周血MDA含量及SOD活性等指标，观察KOR激动剂SA对小鼠ALI的保护作用及其分子机制。 第二章Nrf2在Kappa阿片受体激动剂SA减轻耐甲氧西林金黄色葡萄球菌诱导的小鼠ALI的作用 利用Nrf2基因全身性敲除小鼠，构建MRSA的ALI小鼠动物模型，并给予KOR激动剂SA治疗。通过观察肺组织形态、肺损伤评分、肺泡灌洗液中蛋白浓度和细胞计数、肺组织MPO免疫组化染色和活性测定、肺组织炎症因子的mRNA水平、外周血MDA含量及SOD活性测定等方法，探究Nrf2通路在SA减轻MRSA所致小鼠ALI的作用。 第三章Kappa阿片受体激动剂SA对LTA诱导小鼠RAW264.7细胞凋亡、炎症、氧化应激和Nrf2通路的影响 利用LTA刺激RAW264.7细胞，通过流式细胞术检测细胞凋亡；DHE探针测定细胞ROS的含量；RT-qPCR检测细胞中炎症因子Nrf2、HO-1和Keap-1以及Nrf2下游基因SOD1、SOD2、Gclm和TxnmRNA表达；Westernblot检测Nrf2通路蛋白表达水平，观察SA对Nrf2信号通路及其抑制LTA诱导的RAW264.7细胞凋亡、炎症和氧化应激损伤的影响。 第四章Kappa阿片受体激动剂对LPS诱导大鼠肺泡巨噬细胞NR8383炎症反应的影响 通过LPS（100ng/ml）刺激大鼠肺泡巨噬细胞（NR8383）建立炎症模型。研究KOR激动剂SA（10-6~10-15M）和U50488（10-9~10-11M）对细胞内亚硝酸盐、TNF-α、IL-1β、iNOS和COX-2等炎症因子表达的影响。并用KOR拮抗剂Nor-Bin验证KOR激动剂抑制肺泡巨噬细胞生成促炎细胞因子的作用。 结果： 第一章：KOR激动剂SalvinorinA减轻MRSA感染导致的小鼠ALI。SA缓解MRSA所致肺泡组织结构破坏、中性粒细胞聚集、肺泡内红细胞增多等病理过程；SA降低小鼠肺泡灌洗液中的蛋白浓度和总细胞数、肺组织MPO的含量和活性减少、TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA水平显著降低、外周血MDA含量降低和SOD活性增加。SA增加Nrf2、HO-1和SOD1的mRNA表达水平。 第二章：在Nrf2KO小鼠的气管内滴注MRSA，SA不能抑制中性粒细胞积聚，也不能减轻小鼠肺泡结构破坏，同时，蛋白质含量和BALF中细胞总数没有显著降低。此外，在Nrf2KO小鼠，SA不能降低MPO的活性，也不能抑制TNF-α和IL-1βmRNA水平的表达。 第三章：SA明显降低LTA诱导的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞凋亡和ROS含量。SA抑制LTA诱导的RAW264.7细胞TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA的表达。SA明显提高Nrf2和HO-1的mRNA水平但对蛋白质含量无显著变化。此外，SA使Nrf2下游基因（SOD1、SOD2、Gclm和Txn）mRNA表达也上调。该部分研究显示，SA通过激活Nrf2通路，抑制LTA诱导的RAW264.7细胞内炎症反应、凋亡和氧化应激。 第四章：LPS（100ng/ml）刺激大鼠肺泡巨噬细胞NR8383后1h、2h和6h细胞内TNF-α水平显著升高。SA可降低LPS刺激导致的TNF-α和IL-1β水平的增高。此外，SA可降低LPS诱导的亚硝酸盐水平升高，并可在LPS激活后2h内还能降低iNOS和COX-2的表达，而KOR拮抗剂Nor-Bin可部分阻断这种作用。使用另一种含氮类KOR激动剂U50488处理细胞也得到了类似的结果。 结论： 1.KOR激动剂SA通过Nrf2信号通路减轻MRSA诱导的ALI。 （1）KOR激动剂SA改善MRSA诱导的小鼠ALI。 （2）KOR激动剂SA激活Nrf2信号通路、减轻MRSA诱导的小鼠ALI。 （3）Nrf2基因敲除则使SA不能减轻MRSA诱导的小鼠ALI。 （4）KOR激动剂SA激活Nrf2通路，抑制革兰氏阳性菌致病成分脂磷壁酸诱导的RAW264.7细胞凋亡、炎症和氧化应激损伤。 2.KOR激动剂SA和U50488可抑制革兰氏阴性细菌致病成分LPS诱导的肺巨噬细胞产生促炎因子。 综上所述，KOR激动剂通过激活Nrf2信号通路对感染诱导的ALI发挥保护作用。

关键词

急性肺损伤/Kappa阿片受体/SalvinorinA/耐甲氧西林金黄色葡萄球菌/内毒素/核因子E2相关因子2

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授予学位

博士

学科专业

麻醉学

导师

朱涛

学位年度

2021

学位授予单位

四川大学

语种

中文

中图分类号

R5
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