摘要
背景 淋巴管新生是在初始毛细淋巴管的基础上，产生新的淋巴管的过程。淋巴管新生参与了机体许多重要生理和病理过程。在胚胎发育过程中，淋巴祖细胞通过分化、增殖和迁移形成新的淋巴管；在成年期淋巴管新生受限，仅发生于伤口愈合、淋巴水肿、炎症和肿瘤等生理和病理过程中。促进或抑制淋巴管新生具有十分重要的临床实际意义。例如通过促进淋巴管新生改善淋巴水肿等淋巴管异常造成的局部淋巴液回流障碍，有利于恢复局部淋巴流而对疾病起到治疗作用；抑制肿瘤淋巴管新生，则对肿瘤的生长和转移具有抑制作用，有助于对肿瘤的治疗。 目前临床上尚缺乏有效的调控淋巴管新生用于治疗淋巴管异常的方法。体外和体内实验研究显示，微电场（EF）在伤口愈合、组织再生、血管新生和肿瘤侵蚀等过程中可能发挥重要作用。我们近年研究发现微电场能诱导血管内皮细胞定向迁移、定向排列、形态变长以及管样结构形成等血管新生样反应，鉴于淋巴管内皮细胞与血管内皮细胞存在很多相似的生物学特性，我们设想微电场也能对淋巴管内皮细胞淋巴管新生活性产生重要影响。 因此，本研究通过外加生理性直流微电场作用于体外培养的淋巴管内皮细胞，研究微电场对内皮细胞淋巴管新生作用的影响，定量测定微电场诱导淋巴管内皮细胞的迁移行为和形态的变化、对细胞增殖和细胞周期的影响以及淋巴管样结构的生长情况，并从机理上探索微电场诱发淋巴管内皮细胞膜和胞内与淋巴管新生有关受体和信号传递分子的分布和表达情况，利用转录组测序技术分析内皮细胞淋巴管新生活性相关的差异基因的表达谱变化，了解微电场诱导淋巴管新生反应的分子机制。此外，我们还探讨了微电场对大鼠胸导管环（Thoracicductring）模型淋巴管新生作用的影响。 研究生理性直流微电场对淋巴管内皮细胞淋巴管新生样行为和活性作用的影响及其相关的分子机制，国内外尚未见报道。本研究对探讨微电场影响内皮细胞淋巴管新生及其机制具有理论意义，对应用微电场治疗淋巴管新生异常性疾病具有潜在的应用前景。 方法 首先，为研究微电场对淋巴管内皮细胞行为和形态的影响，本研究利用分离培养的原代淋巴管内皮细胞和淋巴管内皮细胞株加电模型，对微电场诱导的淋巴管内皮细胞的迁移行为和形态的变化进行了检测。 1．分离培养原代大鼠胸导管来源的淋巴管内皮细胞，以及培养人淋巴管内皮细胞株（HLEC），利用免疫荧光化学法对两种细胞淋巴管内皮细胞特异标志分子LYVE-1和VEGFR-3进行染色。 2．对原代淋巴管内皮细胞和HLEC分别用场强为100mV/mm、200mV/mm和300mV/mm的微电场加以刺激，刺激时间为4h、8h、12h和24h。采用显微摄像并对细胞图像进行分析，测定细胞的迁移方向、迁移速度以及细胞形态等的变化。 3．建立原代淋巴管内皮细胞和HLECMatrigel培养模型，用150mV/mm微电场刺激培养细胞0~8h，显微摄像并对细胞管样结构形成长度以及分支点数量和成管数量进行分析。 同时，为探讨微电场刺激淋巴管内皮细胞淋巴管新生效应的分子机制，我们利用转录组测序技术分析了内皮细胞淋巴管新生活性相关的差异基因的表达谱变化，对微电场诱导淋巴管新生反应的相关蛋白和活性分子进行了测定。 4．用200mV/mm的直流微电场刺激淋巴管内皮细胞24h，采用RNA-Seq的方法筛选细胞差异表达基因，并对差异表达基因进行GO分类和KEGG信号通路的富集。 5．随机选取部分差异表达基因采用RT-qPCR方法对RNA-Seq的结果进行验证。 6．通过共聚焦免疫荧光分析法，用200mV/mm微电场刺激培养细胞5min、10min、15min、30min和1h，显微摄像并对内皮细胞VEGFR-2和VEGFR-3的表达活性进行分析。 7．分别用VEGFR-2酪氨酸激酶抑制剂（SU1498，1μM）和VEGFR-3酪氨酸激酶抑制剂（SAR131675，1μM）处理淋巴管内皮细胞，经200mV/mm微电场刺激细胞4h，测定上述受体活性受到抑制后内皮细胞迁移运动的活性。 8．选择与淋巴管新生相关的PI3K/AKT和MAPK信号通路，用WesternBlot方法检测200mV/mm微电场刺激前和刺激后5min、10min、15min、30min和1h内皮细胞AKT、p38、ERK1/2(p44/p42)和eNOS信号分子的磷酸化水平。 9．分别用AKT抑制剂（MK-22062HCL，10μM）、ERK1/2抑制剂（U0126，20μM）、p38抑制剂（SB203580，50μM）以及eNOS抑制剂（L-NAMEHCL，100μM）处理淋巴管内皮细胞，经200mV/mm微电场刺激细胞4h，测定上述活性分子受到抑制后细胞迁移运动的活性。 10．使用WesternBlot方法，分析200mV/mm微电场刺激前和刺激后2、4、6、8、12和24h内皮细胞eNOS的蛋白表达水平。 11．用化学发光法，检测200mV/mm微电场刺激细胞5min-24h的不同时间点以及0、50、100、150、200、250mV/mm的不同电压刺激细胞培养上清中NO的分泌水平。 12．用鬼笔环肽对加电前后淋巴管内皮细胞细胞骨架进行染色。 13．碘化丙啶（Propidium,PI）法检测微电场刺激对淋巴管内皮细胞周期和增殖的影响。 我们还利用大鼠胸导管环培养模型，探讨了微电场对内皮细胞淋巴管新生作用的影响。 14.大鼠胸导管组织淋巴管内皮细胞特异标志分子的染色。 15．大鼠胸导管组织淋巴管新生模型的建立。 16．用150mV/mmEF刺激培养胸导管组织，观察组织块内皮细胞管样结构形成和生长方向。 结果： 1．原代培养的大鼠淋巴管内皮细胞和HLEC，均表达特异淋巴管标志分子LYVE-1和VEGFR-3。 2．微电场介导淋巴管内皮细胞向正极迁移。 未加电刺激的两种淋巴管内皮细胞，其运动缓慢，发生迁移的方向是随机的；在100mV/mm、200mV/mm和300mV/mm电场中两种细胞显示明显的向正极迁移运动（p均＜0.001）；迁移方向在一定范围内呈现刺激电压和时间依赖性。 3．微电场促进两种淋巴管内皮细胞的迁移速度增加。 大鼠原代淋巴管内皮细胞和HLEC细胞在200mV/mm和300mV/mm电场中（4h），细胞平均迁移速度均显著高于未加电对照细胞的速度（p＜0.05~p＜0.001）；EF（200mV/mm）刺激细胞4h、8h、12h和24h，细胞迁移速度较相应的对照细胞均有显著增加（p＜0.05或p＜0.01）。 4．微电场介导两种淋巴管内皮细胞的定向排列和形态变长。 大鼠原代淋巴管内皮细胞和HLEC细胞在100、200和300mV/mm电场中，细胞不对称指数逐渐增加，细胞的长轴逐渐发生垂直于电场方向排列。细胞长：宽比率的增加具有电场刺激时间和刺激强度依赖性。 5．微电场促进两种淋巴管内皮细胞管样结构形成。 以150mV/mm的EF刺激大鼠原代淋巴管内皮细胞和HLEC细胞，EF刺激细胞较未刺激对照细胞管样结构形成长度均显著增加。微电场促进两种淋巴管内皮细胞管样结构形成的特性存在一定的差异：原代大鼠淋巴管内皮细胞与HLEC比较，微电场刺激使前者在更早的时间点促进细胞管样结构的形成。 6．与未加电对照细胞比较，EF200mV/mm刺激HLEC细胞24h，通过RNA-Seq筛选出一些与细胞迁移、细胞增殖、细胞周期、血管生成、细胞黏附和actin细胞骨架组织等相关的差异基因及信号通路，如PI3K/AKT、MAPK和细胞肌动蛋白调节等信号通路。 7．用RT-qPCR对上调基因CORO1C，RTN4，PDCD10，CNBP，TMSB4X，RPS6，RAP1A，NACA，HSPA8，HSPA5，HMGB1，CNN3和ANXA2，以及下调基因BABAM1，PHB2，CARM1，DGK2，FSCN1，HSF1，FLNA和DBN1进行验证，结果与RNA-Seq分析结果一致。 8．VEGFR-2和VEGFR-3的活化参与了微电场介导细胞的应答反应。 用200mV/mmEF刺激淋巴管内皮细胞，在10min时间点，VEGFR-2的磷酸化水平显著增加（p＜0.001），在15-60min磷酸化水平逐渐升高。用微电场200mV/mm刺激淋巴管内皮细胞，在10min时间点VEGFR-3的磷酸化水平显著增加（p＜0.001），在10-15min时间点降低，30min后继续有所降低。抑制VEGFR-2和VEGFR-3的磷酸化活性后，细胞的迁移速度受到了显著的抑制。 9．PI3K-AKT和MAPK的活化参与了微电场介导细胞的应答反应。 用200mV/mmEF刺激细胞，在5min时间点AKT磷酸化水平显著增加（p＜0.05），在15min升高达较高水平（p＜0.001），并在1h时间点内持续磷酸化。EF刺激细胞，MAPK/ERK1/2、MAPK/p38和eNOS磷酸化水平在刺激早期5min时间点均显著增加（p＜0.05）。抑制AKT、ERK1/2、p38和eNOS磷酸化活性后，细胞的迁移速度受到明显的抑制。 10．微电场刺激细胞eNOS蛋白表达水平增加。 与相应未加电对照细胞比较，微电场（200mV/mm）刺激细胞，2、4、6、8、12和24h时间点eNOS蛋白表达水平均显著增加（p＜0.05、p＜0.01或p＜0.001）。 11．微电场促进细胞NO分泌增加。 微电场（200mV/mm）刺激细胞，在5、15、30、60min以及2、4、6、8、12和24小时时间点，与未加电对照细胞（0min）相比，NO的分泌从13倍逐渐增加到811倍（p均＜0.001）。分别用场强50、100、150、200和250mV/mm刺激细胞，NO的分泌均显著高于未加电对照细胞(p＜0.001)。 12．微电场（200mV/mm）刺激细胞24h，细胞骨架应力纤维合成增多且分布均匀，肌动蛋白丝发生重排，细胞明显伸长变形且细胞微丝垂直于电场排列。 13．微电场促进细胞增殖活性。 与未加电对照细胞比较，微电场（200mV/mm）刺激细胞的增殖指数（PI）和进入细胞周期S期的细胞数均显著增加。 14．淋巴管内皮细胞特异标志分子LYVE-1和VEGFR-3在大鼠胸导管组织上呈均匀表达。 15．大鼠胸导管组织培养模型上，培养2d后可见淋巴管内皮细胞向外生长，形成管样结构，且随着培养时间的增加，管样结构形成的数量和长度均进一步增加。 16．150mV/mmEF刺激培养大鼠胸导管组织24h，淋巴管内皮细胞管样结构的生长方向偏向于电场正极的方向；与未加电对照细胞比较，微电场刺激对胸导管组织内皮细胞发芽样管样结构的生长有一定的促进作用。 结论： 1.生理性直流微电场对培养淋巴管内皮细胞的迁移运动、形态和排列以及管样结构形成等淋巴管新生样特性具有促进作用。 2.微电场刺激淋巴管内皮细胞表达的差异基因在与细胞迁移、细胞增殖、细胞周期、血管生成、细胞黏附和肌动蛋白细胞骨架组织等相关的PI3K-AKT、MAPK和肌动蛋白调节等信号通路有显著富集；微电场刺激细胞VEGFR-2和VEGFR-3活化，以及胞内AKT、ERK1/2、p38和eNOS信号分子活化；微电场促进细胞eNOS蛋白表达水平增加和NO分泌增加；微电场刺激细胞骨架肌动蛋白分子发生重排；微电场能促进细胞的增殖和进入细胞周期中S期的细胞显著增加。 3.生理性直流微电场在体外胸导管组织培养模型上对内皮细胞淋巴管新生具有一定促进作用。
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