摘要
目的 急性肾损伤（acutekidneyinjury，AKI）是一种常见的临床综合征，其典型特征是尿量减少、血清肌酐迅速升高或两者兼有。脓毒血症是一种危及生命的临床综合征，是宿主对感染的失调反应，其特点是急性器官功能障碍和高死亡风险。肾脏是脓毒血症过程中最常见的受累器官之一，从而出现脓毒血症诱导的AKI（sepsis-inducedacutekidneyinjury，SI-AKI）。AKI与脓毒血症两者之间存在着紧密联系，AKI是脓毒血症最常见的并发症之一，约60%的脓毒血症患者出现AKI。脓毒血症是AKI最常见的病因，高达50%的AKI与脓毒血症相关。SI-AKI患者的死亡率明显高于脓毒血症未合并AKI患者和其他病因的AKI患者。因此，有必要探索新的治疗方法以提高临床疗效。近些年来，天然化合物由于具有成本低、生物利用度高、毒性小等优点，越来越受到人们的重视和研究。据报道多种天然化合物在保护和缓解AKI中发挥重要作用。尿石素A（urolithina，UA）是人体肠道中微生物代谢分解鞣花单宁和鞣花酸产生的。据报道，UA具有抗炎、抗氧化、和线粒体自噬相关，并且对顺铂造成的肾毒性和肾缺血再灌注损伤也有保护作用。然而，UA在SI-AKI中的作用尚不清楚，因此本研究探讨了UA在SI-AKI中的作用。 材料和方法 1.将小鼠随机分为4组：对照组，UA组，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）组，LPS+UA组。小鼠腹腔注射LPS以构建SI-AKI模型，UA在LPS注射30min之前注射。LPS注射4h后收集各组小鼠血液、尿液和肾脏标本。使用生化自动分析仪检测血清肌酐和尿素氮水平，血清中促炎因子白介素-1（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6和肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）使用酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）试剂盒检测。ELSIA试剂盒检测尿液中肾脏损伤标志物肾损伤分子-1（kidneyinjurymolecular-1，KIM-1）和中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（neutrophilgelatinase-associatedlipocalin，NGAL）。肾脏组织切片使用苏木精伊红染色，在光镜下观察肾小管和肾小球形态，并根据损伤百分比进行定量肾脏损伤评分。 2.体外实验中，用LPS孵育小鼠肾小管上皮细胞（TCMK-1细胞）和小鼠肾足细胞（MPC5细胞）。LPS（不同浓度）对于TCMK-1和MPC5细胞活性的影响通过CCK-8试剂盒检测。选取合适浓度LPS，并且观察UA（不同浓度）对于细胞活性的影响。对LPS和（或）UA处理的小鼠肾足细胞（MPC5）进行RNA二代测序，分析差异表达基因，并且通过GO和KEGG分析可能参与调控的关键基因和信号通路。透射电子显微镜观察LPS对于MPC5细胞形态的影响。GFP-LC3转染MPC5，荧光显微镜观察不同处理组GFP-LC3荧光点情况以检测自噬情况。同时Westernblot检测不同处理组足细胞特异性分子（nephrin和podocin），炎症相关分子（cleaved-caspase-1、pro-caspase-1、cleaved-IL-1β、NLRP3和ASC），自噬相关分子（BNIP3、LC3-Ⅱ和SQSTM1）表达情况。 3.使用BNIP3siRNA转染干扰细胞BNIP3表达，同时通过Westernblot检测不同处理组cleaved-caspase-1、cleaved-IL-1β、NLRP3和BNIP3的蛋白水平。通过免疫荧光观察LC3和TOM20，TOM20和LAMP1，BNIP3、LC3和LAMP1共定位情况。对不同处理小鼠中肾脏组织进行免疫组化以观察BNIP3、NLRP3和LC3-Ⅱ表达情况。 结果 1.与对照组中的小鼠相比，LPS处理的小鼠血清尿素氮、肌酐、IL-1β、IL-6和TNF-α明显升高（P＜0.01）。相比于单纯LPS处理的小鼠，LPS处理之前注射UA的小鼠的血清尿素氮、肌酐、IL-1β、IL-6和TNF-α浓度显著降低（P＜0.05）。LPS组尿液中KIM-1和NGAL的浓度较对照组也显著升高（P＜0.01），LPS+UA可以显著降低KIM-1和NGAL的浓度（P＜0.05）。光镜下可以观察到LPS处理的小鼠肾脏组织发生病理改变，并且肾脏损伤评分显著升高，而加入UA可以显著改善病理改变，并且显著降低肾脏损伤评分。 2.CCK-8实验显示LPS会显著抑制TCMK-1和MPC5的细胞活力，并且随着LPS的浓度升高，细胞活力也显著下降。LPS浓度为0.5ng/ml时，对细胞活性影响显著。并且MPC5对于LPS的处理更敏感，细胞活性下降更明显。加入UA后，细胞活性显著增加，UA在200ng/ml时，治疗效果最佳。并且MPC5对于UA的治疗更敏感，细胞活性改善更显著。二代测序显示LPS和LPS+UA组共有865个差异表达基因。GO和KEGG分析显示差异基因显著富集于细胞缺氧、活性氧、细胞因子、HIF-1信号通路和线粒体自噬等。LPS处理的MPC5细胞在透射电镜下观察到线粒体受损，线粒体膜破坏。然而，LPS加入UA一起孵育MPC5细胞会诱导自噬空泡数量增加，并可观察到线粒体被吞噬的现象。转染GFP-LC3后，荧光显微镜显示对照组的足细胞存在绿色GFP-LC3荧光点，而LPS处理足细胞后，GFP-LC3点较对照组显著减少，然而添加UA后，荧光点显著增加，呈显著聚集趋势。Westernblot检测结果显示与对照组相比，LPS显著降低足细胞特异性相关分子nephrin和podocin的表达水平（P＜0.05）。加入UA后，可以显著改善LPS诱导的nephrin和podocin表达降低（P＜0.05）。LPS处理的足细胞的cleavedIL-1β、cleaved-caspase-1、NLRP3、ASC的蛋白表达水平显著高于对照组（P＜0.05）。而添加UA处理后，cleavedIL-1β和cleaved-caspase-1蛋白水平较单独LPS处理的蛋白水平显著下降（P＜0.05）。Pro-caspase-1蛋白表达水平在四组之间无显著差异。LPS+UA组的NLRP3表达水平较LPS组的有所下降，但是无统计学差异。免疫印迹显示LPS会显著下调BNIP3的表达水平，而SQSTM1的表达水平显著升高（P＜0.05）。与LPS组相比，LPS+UA组会显著上调LC3-Ⅱ、BNIP3的蛋白水平（P＜0.05），而SQSTM1的表达水平显著下降（P＜0.05）。 3.免疫荧光显示与LPS组相比，LPS+UA组的LC3与TOM20荧光点的共定位增强。同时与LPS处理组相比，再加入UA后，LAMP1荧光点和TOM20荧光点聚集，两者共定位同样增强。LPS+UA组的BNIP3、LC3和LAMP1共定位较LPS组也显著增强。转染BNIP3siRNA后，免疫印迹结果显示LPS+si-BNIP3组的BNIP3水平较LPS略微下降，但是无显著差异。LPS+UA的BNIP3表达水平明显高于LPS+si-BNIP3组（P＜0.05）。LPS+UA+si-BNIP3的BNIP3蛋白水平比LPS+UA略微降低，同样无统计学差异。和LPS相比，LPS+si-BNIP3可显著上调cleaved-caspase-1表达水平（P＜0.05）。LPS+UA+si-BNIP3组的cleaved-caspase-1的蛋白水平也显著高于LPS+UA组（P＜0.05）。cleaved-IL-1β在LPS+si-BNIP3处理的足细胞的水平显著高于LPS组（P＜0.05）。与LPS+UA比较，LPS+UA+si-BNIP3同样显著上调cleaved-IL-1β的表达（P＜0.05）。NLRP3在LPS和LPS+si-BNIP3，LPS+UA和LPS+UA+si-BNIP3组之间无显著差异。小鼠肾脏组织的免疫组化显示LPS组的BNIP3表达水平明显低于对照组（P＜0.05），而LPS+UA组的BNIP3表达显著上调（P＜0.05）。类似的，LC3-Ⅱ在LPS处理组的表达水平明显低于对照组（P＜0.05），再进行UA处理后，LC3-Ⅱ的表达显著增加（P＜0.05）。然而LPS处理组的NLRP3的表达显著高于对照组（P＜0.05），LPS+UA处理后会显著降低（P＜0.05）。 结论 1.LPS会造成肾功能显著受损，肾损伤标志物升高，肾脏组织病理改变，同时血清促炎因子水平显著升高。给予UA治疗可显著改善LPS所造成的的上述改变，说明UA对于LPS诱导的AKI具有保护作用。 2.LPS显著抑制细胞活性，而UA可以改善细胞活性，进一步证实UA的保护作用。并且足细胞对于LPS和UA的处理更敏感。细胞因子、细胞缺氧反应、HIF-1和线粒体自噬等可能与UA的保护作用相关。UA可以增强自噬以减轻LPS诱导的足细胞损伤。 3.UA可以调控BNIP3介导的线粒体自噬，部分逆转LPS诱导的NLRP3的激活，从而减轻LPS导致的急性肾损伤。
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