摘要
肿瘤转移往往导致肿瘤治疗失败，是恶性肿瘤高致死率的主要原因。研究表明，肿瘤的发生和转移与细胞氧化应激状态密切相关。活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）在肿瘤细胞中较其周围组织的正常细胞有所增加。一方面，这类轻度氧化应激往往会诱导肿瘤细胞发生异常增殖和转移；另一方面，肿瘤细胞敏感于ROS水平变化，而提高胞内ROS水平能够导致细胞死亡，已成为抑制原发肿瘤增殖和转移的重要策略。 光敏剂受特定波长的激光激发后将电子转移至其周围氧分子（oxygen，O2）以产生ROS，引起局部肿瘤细胞死亡，即光动力疗法（photodynamictherapy，PDT）。然而，光敏剂需要消耗O2产生大量ROS，使得处于低氧状态下的肿瘤缺氧情况加重，限制了PDT的抗肿瘤转移效果。 细胞凋亡状态会受到线粒体的调控。通过线粒体靶向基团将化疗药物靶向递送至线粒体，可损伤线粒体，开放线粒体通透性转换孔（mitochondrialpermeabilitytransitionpores，mPTPs），增加其通透性，释放促凋亡因子导致肿瘤细胞凋亡，并通过下调转移相关因子抑制肿瘤的转移。同时，细胞依赖于线粒体的氧化磷酸化（oxidativephosphorylation，OXPHOS）作用为其生长及转移提供能量，即消耗O2生成三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）。因此，线粒体受损后可导致OXPHOS作用降低，有利于降低细胞耗氧。然而，损伤线粒体能否一方面通过降低细胞耗氧、提高PDT抗肿瘤转移效果，同时另一方面诱导mPTPs开放，激活凋亡途径并与PDT协同发挥抗肿瘤生长及转移的作用，还未见报道，亟待研究。 基于此，本课题构建了一种线粒体靶向药物联用PDT的抗肿瘤转移递药系统，通过线粒体靶向配体甘草次酸（glycyrrhetinicacid，GA）介导阿霉素（doxorubicin，Dox）靶向至线粒体（Dox-GA），提高并协同PDT以实现抗肿瘤转移作用。 本课题以载光敏剂二氢卟吩e6（Chlorine6，Ce6）的明胶纳米粒Ce6@GNP作为内核，将GA修饰的Dox通过pH敏感的腙键接合至N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺（N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide，HPMA）聚合物，得到线粒体靶向的载Dox聚合物P-GD，再将该聚合物通过二硫键连接至明胶纳米粒表面得到共载Dox和Ce6的纳米粒GD/Ce6@GNP。本文以GD@GNP作为线粒体靶向组、Ce6@GNP作为PDT组、GD/Ce6@GNP作为二者联用组，对照组不经过给药处理，开展后续实验。 首先通过自由基聚合反应合成巯基化半遥爪聚合物（P-D），再通过化学修饰将GA连接至Dox末端，得到聚合物P-GD。将上述聚合物P-GD通过末端巯基连接至载Ce6的明胶纳米粒Ce6@GNP，形成粒径为198.0±1.8nm、PDIn为0.191±0.076、带负电（-14.5±1.0mV）的明胶纳米粒GD/Ce6@GNP，且透射电镜下形态圆整呈近球形。GD/Ce6@GNP的Dox和Ce6载药量分别为3.31±0.49wt%和1.32±0.22wt%。在pH7.4磷酸盐缓冲液（phosphatebuffersaline，PBS）条件下，GD/Ce6@GNP中Dox和Ce6的48h累积释放量低于20%；而通过pH敏感的腙键连接的Dox在酸性环境（pH5.0）下48h累积释放量约为85%；包载在明胶纳米粒内部的Ce6在模拟细胞外基质高表达MMP2环境（pH6.5）下48h累积释放量约为90%，表明该纳米粒在肿瘤部位具有pH及酶响应性释药的特点。 接着，以鼠源转移性乳腺癌4T1细胞作为模型进行纳米粒胞内分布的研究。共聚焦结果表明PDT能够协助Dox-GA逃出溶酶体，激光照射后的Dox与溶酶体的共定位系数从0.85降至0.42。同时，线粒体共定位结果显示，经GA修饰后，Dox与线粒体的共定位系数由0.23提高至0.71，表明GA能够介导Dox靶向至线粒体；在PDT作用下，该共定位系数进一步增至0.87，表明PDT可以协助Dox-GA逃出溶酶体，进而增加Dox在线粒体的分布。 为了进一步研究将Dox-GA与PDT联用是否能提高对线粒体的损伤，考察了纳米粒对4T1细胞内ROS水平、mPTPs开放度及ATP水平的影响。结果表明，二者联用后ROS水平可较空白对照组提高4.9倍，mPTPs开放程度增加，ATP的生成减少43%，表明二者联用后可对线粒体功能造成更大的损伤。值得注意的是，GD/Ce6@GNP的细胞耗氧量较Ce6@GNP明显降低，表明Dox-GA能够损伤线粒体并降低细胞对O2的消耗，推测可解除PDT效果受到的缺氧环境的抑制，提高PDT的抗肿瘤作用。 然后，为探究GD/Ce6@GNP对线粒体的损伤增加能否进一步增强对肿瘤细胞增殖和转移的抑制，考察了各组纳米粒诱导4T1细胞凋亡、细胞毒性以及抗肿瘤转移侵袭能力。共聚焦结果表明，Dox-GA与PDT均能诱导细胞凋亡，二者联用后具有最强的诱导肿瘤凋亡作用。细胞毒性结果显示，GD/Ce6@GNP给药24h后，对4T1细胞的IC50仅为3.15±0.80μg/mL（Dox当量），相较于GD@GNP（IC50为57.46±2.67μg/mL，Dox当量），其细胞毒性提高了18倍，二者联用具有最好的抗肿瘤生长作用。同时，划痕实验、Transwell小室转移和侵袭相关实验证明了上述两种策略都能够抑制肿瘤转移，且经GD/Ce6@GNP处理的细胞迁移抑制率与侵袭抑制率分别进一步提高至73%和59%，相较于GD@GNP和Ce6@GNP抑制率最高提升了1.83倍，表明二者联用对线粒体的损伤增加可进一步增强其对肿瘤细胞增殖和转移的抑制。 在荷4T1原位瘤小鼠中的体内分布结果显示，GD/Ce6@GNP在肿瘤组织中的Ce6蓄积量是Ce6@GNP的1.5倍，表明修饰GA的HPMA聚合物增加了明胶纳米粒的肿瘤组织蓄积。荷4T1原位瘤小鼠的体内药效学实验结果显示，GD/Ce6@GNP能够显著抑制肿瘤生长，抑瘤率约为70%，较GD@GNP和Ce6@GNP提高了1.4倍；值得注意的是，GD/Ce6@GNP治疗后，小鼠肺部几乎没有观察到肿瘤转移，其肺部肿瘤结节数量较GD@GNP和Ce6@GNP减少了80%。进一步通过肿瘤免疫组化分析缺氧诱导因子1α（hypoxiainduciblefactor-1α，HIF-1α）发现，经Ce6@GNP治疗后的肿瘤组织中表达较多，肿瘤仍处于缺氧状态。因此，在体内实验中，受到肿瘤缺氧状态限制的Ce6@GNP药效未展现出体外实验中的明显优势，仅与GD@GNP相当；而在GD@GNP及GD/Ce6@GNP治疗后，肿瘤组织缺氧环境明显改善，表明Dox-GA能够有效改善肿瘤缺氧状态，与PDT联用后能更好地实现肿瘤生长及转移的抑制作用。在对荷瘤小鼠治疗过程中，小鼠体重稳定，主要器官的Hamp;E染色结果显示无明显组织毒性。此外，GD/Ce6@GNP给药后的正常健康小鼠的血常规及血生化主要指标也表明本课题构建的纳米递药系统具有较好的安全性。 综上所述，本课题构建了线粒体靶向递送的抗肿瘤药物Dox-GA与PDT联用的递药系统。在肿瘤微环境中，纳米粒GD/Ce6@GNP经基质金属蛋白酶2（matrixmetalloproteinase2，MMP2）降解并释放Ce6和聚合物P-GD。聚合物P-GD进入肿瘤细胞，在溶酶体酸性环境下，连接Dox-GA的腙键水解断裂并释放Dox-GA。接着，Ce6在特定波长激光激发下产生大量ROS，通过损伤溶酶体膜，促进Dox-GA溶酶体逃逸。在GA的线粒体靶向作用下，Dox-GA靶向至线粒体。一方面，Dox-GA通过降低细胞耗氧提高PDT抗肿瘤转移效果；另一方面，诱导mPTPs开放，通过激活细胞凋亡，与PDT协同发挥抗肿瘤生长及转移的作用。两种策略通过“取长补短”，联用后实现更有效的线粒体损伤并改善肿瘤缺氧状态，促进细胞凋亡，抑制肿瘤生长及转移，为治疗转移性肿瘤提供了新的方法和思路。
NETL