摘要
乳腺癌是最常见的癌症之一，亦是女性死亡的第二大诱因。当前针对乳腺癌的治疗手段主要包括手术治疗、化学治疗以及放射治疗等。其中，化疗是临床中应用最广泛的治疗方法，但对癌细胞的选择性差，且具有严重的毒副作用。靶向递药系统可将化疗药物精准高效地递送至肿瘤部位，提高抗肿瘤疗效的同时，降低系统毒副作用。癌细胞中某些高表达的受体分子，可作为治疗药物递送的靶点，通过递药系统的设计与构建实现药物的肿瘤细胞靶向递送。其中，乳腺癌细胞（4T1）表面表达整合素α2β1受体，能够和其他信号途径一起，调节肿瘤的发生、侵袭及转移。DGEA（Asp-Gly-Glu-Ala）是已知发现的一种可特异性识别α2β1整合素受体的多肽，目前主要应用于癌症造影技术。据此，本文设计并构建了一种DGEA多肽修饰的阿霉素脂质体（DGEA-Lipo-DOX），期望其具有良好的肿瘤细胞靶向性能，用于乳腺癌治疗。 本文共分为六个部分。 第一部分为药物含量测定方法的建立。建立了关于阿霉素（DOX）的体外荧光分光光度法、体内液质联用法，并进行了方法学验证，包括标准曲线的建立，专属性、精密度、回收率及稳定性的考察。实验结果显示，各方法学参数均符合标准，所建立的DOX的含量测定方法较为准确。 第二部分为制剂制备工艺的优化与制剂性质表征。脂质体具有良好的靶向性、较高的稳定性和较好的安全性。本课题在传统的脂质体（Lipo-DOX）的基础之上，修饰DGEA靶向肽，包载DOX。经过对制备工艺与处方的进一步优化，成功制备出球形、均一、稳定性强的脂质体。DGEA-Lipo-DOX的平均粒径为121.1±3.8nm，PDI0.232±0.009，Zeta电位为-15.47±0.86mV，透射电镜下可见球形囊泡结构，包封率为83.72±2.82%。体外释放和稳定性研究表明，脂质体组有效减缓了药物的释放，且72h内性质稳定。 第三部分为体外细胞学研究。本部分通过细胞摄取实验，验证了DGEA-Lipo-DOX的靶向性。共聚焦实验和流式细胞实验结果均表明，Lipo-DOX的摄取量低于游离药物；而DGEA-Lipo-DOX可与整合素α2β1受体结合，增加脂质体的细胞摄取。随后，通过细胞毒性实验，验证了制剂在细胞水平上的疗效。结果表明，随着给药浓度的增加，游离组、制剂组对肿瘤细胞的生长抑制作用逐渐增加，且DGEA-Lipo-DOX对肿瘤细胞的杀伤能力较Lipo-DOX高，说明DGEA-Lipo-DOX对肿瘤细胞具有一定的抑制效果。 第四部分对脂质体的药代动力学和体内生物分布进行了研究。本部分以健康SD大鼠为动物模型，进行了药代动力学实验。结果显示，和游离DOX组相比，脂质体组（DGEA-Lipo-DOX、Lipo-DOX组）显著增加了曲线下面积（AUC）和峰浓度（Cmax），降低了药物的清除速率（CLz），减缓了药物的代谢速率，改善了药物的作用效果，增加了药物在血液中的滞留时间。随后，以DGEA-Lipo包载DiD，在荷瘤模型小鼠体内进行了药物分布实验。结果显示，DGEA-Lipo-DiD能够迅速、精准地靶向蓄积到肿瘤部位，且经过48h，DGEA-Lipo-DiD组的荧光依然很强，说明DGEA-Lipo-DiD具有一定的靶向性和长循环性。 第五部分为脂质体的体内药效学研究。本部分以荷瘤Balb/c小鼠为动物模型，进行了药效学实验，并从小鼠体重、肿瘤体积、抑瘤率、免疫组化染色等多方面对体内药效进行详细的考察。结果表明，经过五次小剂量给药治疗后，游离药物组的肿瘤体积有一定程度的减小，但是相比之下，仍不如脂质体组的疗效理想；而DGEA-Lipo-DOX始终将肿瘤控制在200mm3内（151.5±27.4mm3），肿瘤抑制率达43.2%，小鼠体重平稳，中位生存期为47.5天，肿瘤坏死面积和范围最大，具有良好的抑瘤效果。Hamp;E和Ki-67实验结果也显示，DGEA-Lipo-DOX具有最低的增殖活性（3.9%），能较好地抑制癌细胞增殖，并促进癌细胞凋亡，是一种有效的靶向制剂。 第六部分初步评价了脂质体的安全性。结果显示，游离DOX可降低白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血小板（PLT）的数量，具有一定的骨髓抑制作用，而DGEA-Lipo-DOX组的骨髓抑制作用相对轻微；游离药物对心脏有损伤，而脂质体组尤其DGEA-Lipo-DOX组，血生化指标处于正常范围之内，心功能指标与对照组无异，心脏受损较小，且其余脏器无明显病变，说明DGEA-Lipo-DOX具有良好的靶向性，降低了游离药物的毒副作用。 综上，本文构建了一种新型的阿霉素脂质体递药体系，将DGEA多肽首次应用于乳腺癌靶向治疗。脂质体通过靶向整合素受体α2β1，实现药物的特异性乳腺癌细胞靶向递送，增强抗癌效果，为乳腺癌治疗策略的开发奠定了科学基础。
NETL