摘要
研究背景 以免疫检查点抑制剂、溶瘤病毒、CAR-T以及肿瘤疫苗为代表的肿瘤免疫治疗是近些年发展的最有潜力的肿瘤治疗手段之一，其中溶瘤病毒(OncolyticVirus,OV)是当下的研究热点之一，溶瘤病毒可以利用肿瘤细胞缺陷，在肿瘤细胞中复制并最终裂解肿瘤细胞，而对正常组织无害。此外，除了直接靶向肿瘤细胞的杀伤作用之外，被溶瘤病毒杀死的肿瘤细胞会释放肿瘤相关抗原，激发系统性的抗肿瘤免疫反应，清除未被溶瘤病毒感染的肿瘤细胞。截至目前，已经有多种溶瘤病毒用于临床与临床前研究，其中水泡口炎病毒(VesicularStomatitisVirus,VSV)就是其中之一，VSV是一种单链RNA病毒，属于弹状病毒科。临床前研究表明，VSV复制周期短，对肿瘤细胞杀伤作用强，并且能诱导广泛的抗肿瘤免疫效应，例如诱导CD8+T细胞、自然杀伤细胞与中性粒细胞浸润，抗肿瘤效果显著。 然而，不可忽视的是，自然突变的溶瘤病毒很难让肿瘤完全消退。而且在作用一段时间之后，溶瘤病毒也会被机体自身的免疫系统清除，导致治疗效果有限。此外，在实体瘤中，特别是胰腺肿瘤中分布有大量的胞外基质，这些胞外基质由肿瘤相关成纤维细胞(Cancer-associatedfibroblasts,CAFs)产生，主要组成为胶原蛋白与透明质酸。它们会形成天然的物理屏障，阻碍治疗药物在肿瘤中的扩散。另外，胞外基质累积使整个肿瘤变得紧实，肿瘤内部压力升高，官腔坍塌严重，进一步限制了药物渗透。而溶瘤病毒以瘤内给药为主，在高压之下，注射入肿瘤内部的溶瘤病毒会沿着针孔流出，分布在肿瘤表面，而且除了药物粒子之外，胞外基质也会限制抗肿瘤免疫细胞的浸润。研究表明，作为胞外基质的主要来源，CAFs也能促进肿瘤发展，例如CAFs可以募集CD4+CD25+T淋巴细胞至肿瘤微环境中，并将其分化为调节性T细胞(RegulatoryTcells，Tregs),CAFs也可以通过表达检查点配体直接抑制CD8+T细胞的活性。 常山酮提取于中药常山，作为一种抗球虫药广泛应用于家禽行业。研究表明，常山酮具有良好的抗纤维化作用，能够有效抑制成纤维细胞的激活与胞外基质的累积，有效促进化疗药物在肿瘤组织中的扩散。除了能抑制CAFs的活化之外，它还能抑制肿瘤细胞的增殖。因此，常山酮与溶瘤病毒联合给药，将能增强溶瘤病毒与肿瘤特异性T细胞在肿瘤组织中的浸润，发挥出更强大的抗肿瘤效应。 研究目的 (1)构建多个小鼠肿瘤模型，评价常山酮与VSV联合用药的治疗效果；(2)用流式细胞术与免疫组化等多种实验技术手段深入研究联合用药的抗肿瘤免疫机制；(3)为该联合给药的临床应用提供实验依据，同时为临床上肿瘤治疗提供新的策略与思路。 研究方法 1.体外实验评价常山酮与VSV抗肿瘤效果 利用CCK8评价常山酮与VSV对多种肿瘤细胞增殖的抑制作用，评估二者有无协同作用。 2.研究该联合疗法的体内治疗效果 构建小鼠结肠癌CT26和MC38皮下移植瘤模型，人胰腺癌细胞SW1990皮下移植瘤模型，治疗之后，通过观察小鼠肿瘤体积，小鼠生存期等指标评价联合用药的体内治疗效果。 3.间质微环境分析 通过HE染色，Masson染色，FAP免疫组化与α-SMA免疫荧光分析常山酮对胞外基质累积的影响，评价常山酮对CAFs活化状态的影响。 4.免疫微环境分析 (1)利用流式细胞术，免疫荧光等实验技术分析肿瘤微环境中CD3+,CD4+,CD8+T淋巴细胞等的浸润比例，分布区域。 (2)利用流式细胞术等实验手段分析肿瘤微环境中调节性T细胞，肿瘤相关巨噬细胞，髓源抑制性细胞等的浸润比例。 (3)利用流式细胞术等实验手段分析肿瘤微环境中成熟树突状细胞的浸润比例，活化状态。 (4)利用Q-PCR实验分析肿瘤微环境中免疫抑制性基因TGF-β，IL-10与CD206的表达情况。 研究结果 1.体外实验中，常山酮能够增强VSV对多种肿瘤细胞的杀伤作用 常山酮与VSV均对SW1990，CT26，MC38等细胞系的增殖有限制作用，特别是VSV。此外，常山酮还能增强VSV对CT26和MC38等细胞系的杀伤作用。 2.在体内，常山酮能够增强VSV的抗肿瘤效应 联合疗法显著抑制了SW1990，CT26，MC38皮下移植瘤的生长，并显著延长了小鼠的生存期，在SW1990模型中，57%的荷瘤小鼠在经过联合治疗后肿瘤完全消退。 3.常山酮重塑了肿瘤的间质微环境 在SW1990模型中，常山酮明显减少了肿瘤组织中胞外基质的累积，抑制了CAFs的活化。此外，免疫组化结果显示肿瘤中胶原纤维呈网格状分布，将肿瘤分割成了一个个独立的小单元，常山酮能将这些排列有序的网格打破。 4.常山酮增强了VSV在肿瘤中的扩散，使肿瘤血管回归正常化，联合用药促进了CD8+T细胞在肿瘤组织中的浸润与树突状细胞的活化。 联合疗法显著促进了VSV在肿瘤组织中的扩散，使VSV渗透到肿瘤组织的中心地带并且分布到更广范围。另外，随着胞外基质累积的下降，肿瘤内部曾经受挤压变形，坍塌的血管回归正常化，进而促进了CD3+，CD8+T细胞的浸润。 5.常山酮与VSV通过限制免疫抑制性细胞的浸润，重塑了免疫抑制性微环境 VSV显著降低了调节性T细胞在肿瘤微环境中的浸润，常山酮与VSV都能减少肿瘤相关巨噬细胞与髓源抑制性细胞的浸润，但是联合治疗组与VSV组之间没有统计学差异。 结论 常山酮能够显著减少实体瘤中胞外基质的累积，并且可以抑制CAFs的活化与增殖，使肿瘤的间质微环境趋于正常化。经过常山酮治疗之后，受挤压变形甚至坍塌的肿瘤血管重新扩张，促进了VSV与肿瘤特异性T淋巴细胞在肿瘤组织中的扩散，发挥出更大的抗肿瘤效应。此外，常山酮与VSV还能通过减少免疫抑制性细胞的浸润，有效调节免疫抑制性肿瘤微环境。本研究为肿瘤联合免疫治疗提供了新的思路和实验依据，具有良好的临床应用前景。
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