摘要
研究背景： 术后认知功能障碍（Postoperativecognitivedysfunction,POCD）是患者麻醉手术后常见的并发症，与患者术后死亡率和致残率增高密切相关。术后认知功能障碍的分子生物学发病机制已取得众多进展，但目前POCD的防治效果仍不乐观，探索POCD的潜在神经环路机制，将有助于准确干预介导POCD的异常神经环路，进而改善认知功能。近年来，随着遗传学技术的发展，我们可以实现精准激活和抑制不同脑区神经元的活动，以研究相关的神经环路机制。外侧缰核（Lateralhabenula,LHb）在功能上与背侧海马相互作用，是连接边缘前脑和中脑单胺能核的枢纽，在调节动机和认知等过程中起着重要作用。腹侧被盖区（Ventraltegmentalarea,VTA）是中脑多巴胺能神经元集中的核团，向前额叶皮层、海马等众多脑区释放多巴胺，在调节树突棘生长和认知功能中具有重要作用。本课题拟探讨LHb-VTA神经环路在POCD发生中的作用与潜在机制，以期为POCD的预防和治疗提供新的靶点。 第一部分边缘系统-LHb-VTA神经网络与术后认知功能障碍的关系 目的： 探讨与认知相关的脑区术后神经元激活情况，探索介导POCD发生的潜在神经环路。 方法： （1）使用CD1雄性8周龄小鼠30只随机分为2组（n=15只）：对照组（Control组）和手术组（Surgery组）。手术组用1.8％异氟烷麻醉小鼠，将小鼠暴露于异氟烷30min后，沿颈正中线切开约1.5cm纵向切口，暴露气管前部位，在气管右侧游离右颈总动脉约1cm，适度牵拉探查右颈总动脉，手术时间为15min，缝合切口，麻醉总时间为2h，手术后，所有动物皮下注射布比卡因3mg/kg。对照组吸入空气/氧气（1∶1）2h，不予以麻醉手术。术后第4天进行旷场实验（Openfield,OF），术后第5天进行新物体识别实验（Novelobjectrecognition,NOR），术后第6天进行巴恩斯迷宫实验（Barnesmaze,BM）行为学训练，连续训练4天后，分别于术后第10天和第17天进行巴恩斯迷宫实验短期和长期记忆测试；术后第18天进行条件性恐惧实验（Fearconditioning,FC）训练，24h后进行环境联系性（Context-related）记忆测试和声音联系性（Tone-related）记忆测试，观察凝滞（Freezing）时间。（2）使用CD1雄性8周龄小鼠12只随机分为2组（n=6只）：对照组（Control组）和手术组（Surgery组）。术后3h将2组小鼠断头取脑浸泡于10%中性福尔马林4℃环境72h后进行石蜡包埋、切片，免疫荧光染色计数海马（Hippocampus,HIP）、前额叶皮层（Prefrontalcortex,PFC）、内侧缰核（Medialhabenula,MHb）、外侧缰核（Lateralhabenula,LHb）、丘脑室旁核（Paraventricularthalamicnucleus,PVT）、中间丘脑核（Mediodorsalthalamicnucleus,MD）、杏仁核（Amygdala）和腹侧被盖区（Ventraltegmentalarea,VTA）c-Fos阳性细胞个数。 结果： （1）手术组小鼠和对照组小鼠自主活动能力无统计学差异（P＞0.05）。手术组小鼠新物体探索时间显著短于对照组（P＜0.01）。在巴恩斯迷宫实验训练阶段，手术组和对照组小鼠随着训练时间增加，识别目标盒子的时间均减少（P＜0.05），但手术组减少程度显著低于对照组（P＜0.05）；在巴恩斯迷宫短期和长期记忆测试阶段，手术组小鼠识别目标盒子的时间均显著长于对照组（分别P＜0.01，P＜0.01）。在条件性恐惧实验中，手术组小鼠环境联系性记忆测试和声音联系性记忆测试的凝滞时间均显著短于对照组（分别P＜0.01，P＜0.05）。（2）免疫荧光结果显示手术组小鼠PFC、LHb、PVT、MD、杏仁核和VTA的c-Fos阳性细胞数均高于对照组（P＜0.01），其中对照组LHb和VTA区c-Fos表达极少但在术后c-Fos表达显著增加（P＜0.01）。 结论： 右侧颈动脉暴露手术导致小鼠术后认知功能障碍；麻醉手术引起多个脑区神经元激活，其中LHb和VTA神经元在术后显著激活，LHb和VTA脑区可能参与介导POCD发生。 第二部分LHb-VTA神经环路在术后认知功能障碍中的作用 目的： 从整体动物和分子层面，利用行为学方法、化学遗传学、化学毁损、Westernblot和免疫荧光等技术，探讨LHb-VTA神经环路在POCD中的作用。 方法： （1）LHb脑区转染病毒pAAV2-hSyn-mCherry，研究LHb到VTA的神经投射及类型。（2）Westernblot、免疫荧光和化学遗传学技术研究术后LHb-VTA神经环路活性。（3）采用化学遗传学技术操控LHb-VTA神经环路活性，研究LHb-VTA神经环路对术后认知功能的影响。术后第4天进行旷场实验，术后第5天进行新物体识别实验，术后第6天进行巴恩斯迷宫实验行为学训练，连续训练4天后，分别于术后第10天和第17天进行巴恩斯迷宫实验短期和长期记忆测试；术后第18天进行条件性恐惧实验训练，24h后进行环境联系性记忆测试和声音联系性记忆测试。（4）化学毁损LHb观察其在术后认知功能中的作用。术后第4天进行旷场实验，术后第5天进行新物体识别实验，术后第6天进行巴恩斯迷宫实验行为学训练，连续训练4天后，分别于术后第10天和第17天进行巴恩斯迷宫实验短期和长期记忆测试；术后第18天进行条件性恐惧实验训练，24h后进行环境联系性记忆测试和声音联系性记忆测试。 结果： （1）LHb到VTA有直接神经投射，LHb神经投射纤维与VTA区vGluT2存在大量共染。（2）术后3h、24h、48hLHb和VTA区c-Fos蛋白表达均显著高于对照组（分别P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05），术后72h降至对照组水平（P＞0.05）。化学遗传学技术有效地抑制了术后LHb-VTA神经环路异常激活，术后LHb和VTA区c-Fos表达均显著降低（分别P＜0.01，P＜0.01）。（3）抑制LHb-VTA神经环路异常激活显著增加术后小鼠新物体探索时间（P＜0.05），改善术后小鼠在巴恩斯迷宫的学习曲线（P＜0.05），降低在巴恩斯迷宫短期和长期记忆测试中识别目标盒子的时间（分别P＜0.05，P＜0.01），在条件性恐惧实验中增加术后小鼠环境联系性记忆测试和声音联系性记忆测试的凝滞时间（分别P＜0.01，P＜0.05）。（4）化学毁损LHb显著降低术后VTA区c-Fos蛋白表达（P＜0.01），且显著增加术后小鼠新物体探索时间（P＜0.05），改善术后小鼠巴恩斯迷宫实验学习曲线（P＜0.05），降低巴恩斯迷宫短期和长期记忆测试中识别目标盒子的时间（分别P＜0.01，P＜0.01），在条件性恐惧实验中增加术后小鼠环境联系性记忆测试和声音联系性记忆测试的凝滞时间（分别P＜0.05，P＜0.01）。 结论： LHb至VTA有直接谷氨酸能神经投射；术后LHb-VTA神经环路过度激活，抑制LHb-VTA神经环路激活改善小鼠术后认知功能；化学毁损LHb对小鼠正常认知功能无显著影响，且改善术后小鼠认知功能；LHb-VTA神经环路参与介导了POCD的发生。 第三部分LHb-VTA神经环路通过激活NMDA受体引发内质网应激介导POCD的发生 目的： 采用Westernblot、ELISA、免疫组织化学技术、TUNEL染色、高尔基染色和行为学，从整体动物和分子层面探讨术后LHb-VTA神经环路激活与内质网应激的关系，并探讨NMDA受体在其中的作用。 方法： （1）利用免疫组织化学技术、Westernblot、TUNEL染色和ELISA法研究术后LHb-VTA神经环路激活对VTA区NMDA受体活性、内质网应激、炎症反应和凋亡的影响。采用高尔基染色法研究术后LHb-VTA神经环路激活对前额叶皮层和海马树突棘密度的影响。（2）从整体动物和分子水平研究VTA区NMDA受体对术后认知功能的影响。Westernblot检测术后24h、48h和72hVTA区NMDA受体激活情况；利用免疫组织化学技术、Westernblot、TUNEL染色和ELISA法研究VTA区NMDA受体对内质网应激、炎症反应和凋亡的影响。术后第4天进行旷场实验，术后第5天进行新物体识别实验，术后第6天进行巴恩斯迷宫实验行为学训练，连续训练4天后，分别于术后第10天和第17天进行巴恩斯迷宫实验短期和长期记忆测试；术后第18天进行条件性恐惧实验训练，24h后进行环境联系性记忆测试和声音联系性记忆测试，以观察VTA区NMDA受体对术后认知功能的影响。（3）从整体动物和分子水平研究VTA内质网应激对术后认知功能的影响。利用免疫组织化学技术、Westernblot、TUNEL染色和ELISA法研究内质网应激对VTA炎症反应和凋亡的影响。术后第4天进行旷场实验，术后第5天进行新物体识别实验，术后第6天进行巴恩斯迷宫实验行为学训练，连续训练4天后，分别于术后第10天和第17天进行巴恩斯迷宫实验短期和长期记忆测试；术后第18天进行条件性恐惧实验训练，24h后进行环境联系性记忆测试和声音联系性记忆测试，以研究VTA内质网应激对术后认知功能的影响。 结果： 与对照组相比，术后24h、48h小鼠VTA区p-NR1水平显著增加（P＜0.01），72h降至对照组水平（P＞0.05），与术后LHb-VTA神经环路激活一致。术后VTA内质网应激相关蛋白CHOP和XBP1s表达显著增加（分别P＜0.01，P＜0.01），炎症因子IL-1β、IL-6浓度显著增加（分别P＜0.01，P＜0.01），Cleaved-Caspase3水平增加（P＜0.01），细胞凋亡率增加（P＜0.01），多巴胺能神经元减少（P＜0.01），前额叶皮层和海马树突棘密度显著降低（P＜0.01）。抑制LHb-VTA神经环路异常激活术后VTA区NMDA受体激活水平降低（P＜0.05），CHOP和XBP1s表达降低（分别P＜0.01，P＜0.01），炎症因子IL-1β、IL-6浓度降低（分别P＜0.01，P＜0.01），细胞凋亡减少（P＜0.01），多巴胺能神经元增加（P＜0.05），术后海马和PFC树突棘密度增加（P＜0.01）。抑制VTA区NMDA受体激活和内质网应激均降低术后VTA区CHOP和XBP1s表达（P＜0.05），降低炎症因子IL-1β、IL-6浓度（P＜0.01），减少细胞凋亡（P＜0.01），减少VTA多巴胺能神经元丢失（P＜0.01）。抑制VTA区NMDA受体异常激活和内质网应激显著增加术后小鼠新物体探索时间（P＜0.05），改善术后小鼠在巴恩斯迷宫的学习曲线（P＜0.05），降低巴恩斯迷宫短期和长期记忆测试中识别目标盒子的时间（P＜0.05），在条件性恐惧实验中增加术后小鼠环境联系性记忆测试和声音联系性记忆测试的凝滞时间（P＜0.05）。 结论： 术后LHb-VTA神经环路过度兴奋，通过激活NMDA受体诱导VTA内质网应激，引起VTA炎症反应和细胞凋亡，多巴胺能神经元减少，前额叶皮层和海马树突棘密度减少，进而导致术后认知功能障碍。
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