摘要
畜禽粪便作为抗生素抗性菌和抗生素抗性基因（ARGs）的天然储存库，其引发的环境风险也越来越受到研究者们的关注。厌氧消化是畜禽粪便的主要生物处理方式之一，当前纳米氧化锌（ZnONPs）作为饲料添加剂在畜禽养殖业的应用不可避免地导致其在畜禽粪便的分布，这必然会影响畜禽粪便厌氧消化的效果及当中ARGs的行为。此外，ZnO NPs在畜禽业的使用或管理不善甚至会导致畜禽粪便中出现极端浓度的ZnO NPs，但是相关的研究还甚少。因此，揭示ZnO NPs，尤其是极端浓度下，对畜禽粪便厌氧消化效果的影响规律，以及对新型污染物ARGs行为的驱动机制，不仅有利于拓展对畜禽粪便厌氧消化的认识，还为在纳米饲料添加剂施用下，畜禽粪便ARGs的生态风险评价和控制提供理论依据。 本研究考察了ZnO NPs对牛粪厌氧消化的效果及当中ARGs行为的影响。首先，通过响应曲面法对牛粪厌氧消化的运行条件（温度、初始pH值、总固体（TS）含量）进行优化，确定最佳条件；其次，基于上述优化条件，考察在不同浓度ZnONPs（0、5、30、100mg/gTS）下，牛粪厌氧消化效果的差异；并通过16S rRNA高通量测序技术，从微生物群落、功能蛋白及代谢通路等角度，揭示ZnO NPs对牛粪厌氧消化过程的深层作用机制；最后，基于宏基因组学，阐明ZnONPs（5mg/gTS）对牛粪厌氧消化过程中ARGs行为的驱动机制，主要包括ARGs丰度和多样性变化特性、ARGs与微生物群落的相关性，以及微生物潜在抗生素抗性机制通路。主要结果如下： （1）通过响应曲面法建立了在温度30~55℃、初始pH值为6~10、TS含量6~15%区间内的甲烷产量预测模型：Y=287.93-19.312A+10.58B-3.05C+0.38AB+0.32AC-0.05BC+0.15A2+0.12B2+0.09C2 其中，Y为甲烷产量，A、B、C分别代表初始pH值、温度和TS含量的编码值。模型方差分析表明模型对实际情况拟合较好，并且温度为最显著的影响因素。经验证得到牛粪厌氧消化最优的运行条件：温度为55℃、初始pH值为10、TS含量为6%。 （2）ZnONPs有利于溶解性有机物的积累，但抑制了挥发性脂肪酸（VFAs）的消耗/产生，进而减少总甲烷产量，在5、30、100mg/gTS的ZnONPs存在下，累积产甲烷量与对照组相比分别下降了84.55%，92.39%和93.72%。其中，5mg ZnONPs/gTS对溶解性多糖（SP）和溶解性蛋白（SC）的降解抑制效果不显著，但是抑制了VFAs的消耗，导致体系中VFAs的积累，抑制产甲烷过程，同时，丁酸向乙酸转化的过程也受到抑制。30mg/gTS和100mg/gTS的ZnO NPs长期（30天）暴露会抑制SP和SC的降解导致产酸及产甲烷效果极差。 （3）在ZnO NPs暴露下，具有水解、产氢产酸功能的微生物，如Ruminococcaceae、Heliobacteriaceae和Lachnospiraceae的相对丰度降低，导致VFAs的产生及消耗受到抑制，后续产甲烷阶段的底物减少。同时，ZnONPs降低了主要产甲烷功能菌Methanothermobacter的丰度，且更有利于以H2和/甲酸盐为底物的产甲烷化途径发生。 （4）功能蛋白和KEGG通路的分析结果表明，虽然ZnO NPs使编码厌氧消化相关功能（如：氨基酸、碳水化合物的代谢和转化、甲烷代谢）的基因丰度增加，但其最终的表现可能受到ZnONPs的抑制。此外，在ZnONPs的胁迫下，细胞为提高自我防御与适应能力，能量代谢、信息存储和处理、细胞壁/膜生物发生过程、无机离子运输和代谢以及信号转导等功能相关的基因丰度增加。 （5）5mg/gTS的ZnO NPs有利于牛粪厌氧消化中总ARGs的削减（减少6.6%），其中，ZnONPs对多药类、多肽类、氟喹诺酮类、氨基香豆素类等相对丰度较高的ARGs有显著的去除效果；ZnONPs对ARGs行为的作用会因ARGs编码的抗性机制不同而异，如ZnO NPs减少了与抗生素靶点改变及抗生素靶点保护相关的ARGs相对丰度，而增加了与抗生素失活相关的ARGs相对丰度；同时，ZnO NPs也可以通过抑制宿主繁殖而降低部分ARGs的丰度，如削减了与Ruminiclostridium、Riminococcus、Paenibacillus正相关的ARGs（如：vanRF、patB、murA、lmrD和arlS）；此外，细菌趋化性通路富集分析结果表明ZnONPs可能抑制牛粪厌氧消化微生物的趋化性，影响微生物对环境的适应能力，抑制ARGs的传播能力。 综上所述，本文深入分析了ZnO NPs对牛粪厌氧消化效果和ARGs行为的影响及其作用机制，为在纳米级饲料添加剂存在下，畜禽粪便的资源化利用，以及ARGs环境风险评估和控制提供新的见解。
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