摘要
坏死性小肠结肠炎（Necrotizingenterocolitis,NEC）是新生儿最常见的胃肠道致死性疾病之一，在早产儿中尤为多见。随着早产儿救治技术的进步，早产儿存活率不断增加，使得该病的发生率仍在逐渐升高，但由于缺乏特异性的诊治措施，NEC的死亡率仍居高不下，可达15%-30%。NEC以小肠结肠斑片状坏死为主要特征，并可迅速进展，发展为败血症，多器官衰竭，导致死亡。尽管国内外存在大量NEC相关的研究报道，包括流行病学、细胞及动物实验以及临床研究，其确切的病因及发病机制尚未明确阐明。目前研究认为是多因素相互作用的结果：肠上皮细胞中Toll样受体异常表达、肠道黏膜屏障功能障碍、肠道缺血再灌注、菌群移位定殖及过度炎症反应共同作用导致肠稳态破坏进而NEC的发生发展。 目前有研究发现NEC肠上皮中有大量免疫细胞浸润，这些免疫细胞的自然本性和作用引起了我们的重视：免疫细胞可能参与并介导NEC的发生与发展。在不成熟早产儿中，免疫成熟时间不足可能是其容易感染、发生败血症和NEC的重要原因。肠道上皮细胞TLR4介导的淋巴细胞聚集可以诱发NEC。同时TLR4信号通路可能是引起抗原呈递细胞的关键信号转导通路之一，该通路可以活化DC细胞，引起DC细胞表面PD-L1的表达升高，推测PD1/PD-L1信号通路可能参与NEC的发生发展。 程序性死亡受体配体-1（PD-L1），是一种40kDa的跨膜蛋白，在免疫细胞和上皮细胞上都有着广泛的表达。有研究表明PD-L1不仅仅作为程序性死亡受体配体与PD-1结合参与适应性免疫的调控，PD-L1同样可以作为受体配体结合的信号端调节机体的先天性免疫。目前已经有报道指出PD-L1在败血症、胰腺炎等炎性疾病中的重要调控作用。我们团队前期研究发现：在NEC动物模型中，PD-L1表达明显增高，并且PD-L1表达变化与NEC小鼠肠道病变严重程度呈正相关。 综上我们推测PD-L1参与NEC的发生发展，但PD-L1在NEC发生发展中具体变化趋势及途径还尚不明确。本研究旨在探讨PD-L1在NEC发生发展中的作用及其可能的途径，为NEC的诊断和治疗提供转化思路和实验依据。 目的： (1)探讨PD-L1在NEC发病中表达的变化和规律； (2)探讨阻断PD-L1通路对NEC发病的影响 方法： (1)用4日龄小鼠（C57BL/6J）60只，随机分入造模组与对照组，每组30只，不分雌雄； (2)造模组采用LPS+配方奶喂养+缺复氧+冷刺激的方法诱导NEC发生，对照组与母鼠同笼，母乳喂养，不给予特殊处理； (3)分别在诱导第24h、48h和72h取小鼠肠道做HE染色评估肠道病变程度，同时取外周血进行流式检测，分析炎症细胞以及PD-L1表达的变化； (4)利用杂合C57小鼠（C57BL6/JGptCD274em1Cd302d12132/Gpt）繁育获得PD-L1（+/+）小鼠与PD-L1（-/-）小鼠，各取14只随机分入造模组与对照组；造模组进行NEC诱导（方法同上），对照组与母鼠同笼喂养； (5)处理结束后，取小鼠回肠末段组织，行HE染色评估肠道病变严重程度；利用液相芯片分析小鼠外周血炎症因子的表达情况；同时检测小鼠肠道MPO活力，评估肠道中性粒细胞的浸润情况； 结果： (1)在C57BL/6J小鼠中，在相同诱导时间点，与母乳对照组相比，NEC造模组小鼠外周血白细胞数量增加；随着诱导时间增加，白细胞中中性粒细胞比例也明显增加，而T细胞与单核细胞占白细胞比例无明显变化。 (2)在C57BL/6J小鼠中，与母乳对照组相比，随着诱导时间增加，NEC造模组小鼠外周血中性粒细胞PD-L1表达有明显上调，T细胞与单核细胞的PD-L1表达在NEC诱导后无明显变化。 (3)与PD-L1（+/+）小鼠相比，PD-L1（-/-）小鼠在NEC诱导后体重下降，NEC发病率增加，肠道病变程度加重； (4)相较于PD-L1（+/+）小鼠，PD-L1基因缺失使得CXCL1、IL-1β、IL-6在NEC小鼠外周血中表达增加，而IL-10表达下降，小鼠肠道MPO活力上升。 结论： (1)在小鼠NEC模型中，中性粒细胞为外周血中增长最快、增长幅度最大的白细胞亚群；在各白细胞亚群中，中性粒细胞表面PD-L1表达上调最快、上调幅度最大； (2)PD-L1基因缺失，小鼠NEC发病率升高，肠道病变程度明显加重，PD-L1在NEC发生过程中起抑炎保护作用； (3)PD-L1基因缺失，NEC小鼠机体炎症反应加重，肠道中性粒细胞浸润增加。
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