摘要
癌症日益成为困扰人类健康的严重问题。目前，肿瘤治疗的主要手段为化疗、放疗以及手术切除。化疗药物如紫杉醇、阿霉素等存在加速癌细胞转移的风险、手术切除造成局部生物力学缺陷，且病灶内残存的肿瘤细胞或术中肿瘤组织与正常组织的接触均有引起肿瘤原位复发或再次转移的风险。以骨肉瘤为例，约30%-40%局限性骨肉瘤患者在手术切除后随访中出现局部或远处复发，导致这些患者的5年生存率仅为23-29%。因此，研究人员越来越关注开发具有抗癌特性的新型生物材料，以提高肿瘤治疗以及辅助治疗的效果。 目前抗癌材料的设计方案主要是通过调整材料的力学性能。肿瘤微环境的力学特性在调节癌细胞增殖和凋亡方面起着重要作用。报道称骨肿瘤细胞的增殖与底物的硬度呈正相关，骨肉瘤的增殖能力随着凝胶硬度的降低而逐渐降低；此外，研究发现通过增加肿瘤微环境中的应力，可以诱导正常细胞中与肿瘤相关的β-链蛋白和Ret信号通路的激活，同样也佐证了力学微环境在肿瘤的启动过程中发挥了极为关键的作用。常规调控基质材料模量途径与细胞通过MyosinⅡ感受周围力学微环境以及Rho-Rock通路高度相关。除了材料的力学性能外，迁移能力是调控癌细胞的活性及转移的另一潜在重要但又常被忽视的因素。受到细胞外基质粘附变化等物理化学信号的刺激，细胞的迁移能力这一细胞的基本行为造成的内应力引起力学-化学信号传导，引起细胞凋亡等行为的变化。本课题以此为理论研究基础，构建调控癌细胞迁移能力的平台，诱导癌细胞凋亡，并探究细胞的低迁移能力诱导肿瘤细胞凋亡的机制。本课题的研究结果有助于理解诱导肿瘤细胞凋亡的潜在机制，并为设计新型抗肿瘤材料提供新的策略。 本论文主要从材料学的角度出发，对基底材料的表面进行改性以调控癌细胞在基底材料表面的迁移能力。在此调控细胞迁移能力的平台上研究细胞迁移与细胞凋亡之间的关系。并引入了高通量分析手段结合生物组学分析进一步探究调控细胞迁移能力诱导细胞凋亡的内在分子机制。论文的主要研究内容如下： 1、在本实验中，选用40kPa的聚丙烯酰胺(PAM)水凝胶作为基底材料，为骨肉瘤细胞提供与胶原骨相似刚度的生长环境。利用细胞粘附因子RGD多肽对聚丙烯酰胺水凝胶表面进行改性，构建了调控细胞迁移能力的材料平台。不同浓度的RGD多肽改性PAM水凝胶，有效的调控细胞的迁移速率。且聚丙烯酰胺水凝胶材料表面接枝高浓度RGD多肽时，MG-63细胞的迁移能力受到了明显的限制。为了进一步减少材料学因素差异对细胞凋亡的潜在影响，我们还使用了化学药物--塞来昔布直接作用于骨肉瘤细胞，抑制细胞迁移，进一步验证是通过调控细胞迁移能力这一基本细胞行为诱导细胞凋亡。随着使用塞来昔布浓度的增高，细胞的迁移能力降低。通过迁移能力调控癌细胞的活性以及转移。 2、在调控细胞迁移能力的平台之上，探究细胞迁移能力的变化与细胞凋亡之间的联系。细胞的迁移能力受到抑制时，癌细胞的凋亡率明显提高。未经任何处理的细胞的凋亡率为9.49%，与之相比，迁移能力受限的细胞，凋亡率达到27.50%，提高了约3倍。除了从细胞水平进行表征外，还从蛋白水平检测了凋亡相关蛋白如Caspase-3、PARP的表达量，结果进一步的表明细胞迁移能力受限有明显的促进细胞凋亡作用。 3、引入了高通量分析手段并结合生物信息学对抑制细胞的迁移能力促进癌细胞凋亡的分子机制进行了系统的分析。通过RNA-seq检测，并结合生物信息学GO分群和KEGG信号通路的富集，分析认为肿瘤细胞的迁移能力降低抑制典型的Wnt信号通路，导致了Bcl-2家族相关基因水平的上调，改变了线粒体膜的通透性，使细胞色素C从线粒体中释放，形成了凋亡小体，促进caspase-9和caspase-3的激活，最终通过线粒体caspase依赖性信号通路调控MG-63细胞的凋亡。此外，进一步对抑制细胞的迁移能力促进癌细胞凋亡的分子机制进行了验证。利用蛋白印迹法检测了Wnt信号通路相关蛋白的表达情况，并通过HLY-78--Wnt信号通路的特异性激活剂，发现激活Wnt-β-catenin通路可显著抑制MG-63细胞凋亡，进一步提示Wnt信号通路在运动调控肿瘤细胞凋亡中发挥关键作用。 本论文中，构建了有效调控细胞迁移能力的材料平台。在此基础上，发现细胞的迁移能力受限与MG-63细胞凋亡比例明显提高相关。MG-63细胞的迁移受到限制后，抑制了Wnt信号通路，β-catenin蛋白被降解无法进入核内，抑制了TCF/LEF下游基因的转录，进而诱导线粒体caspase-dependent信号通路，导致骨肉瘤细胞MG-63凋亡。这些发现为研究癌细胞凋亡机制提供了重要的见解，并为设计新型抗肿瘤材料提供了新的策略。
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