摘要
以光动力疗法（PDT）为代表的光学治疗方法因其非侵入性、局部靶向、操作方便、不受肿瘤类型限制、与其他治疗方法兼容性强等优点成为了目前肿瘤治疗研究的热点。但常用光敏剂疏水性强、缺乏靶向性等问题严重削弱了其治疗效果。近年来，纳米生物技术以及纳米医药的发展推动了PDT的进步，其中纳米药物载体利用其独特的纳米级尺寸可将光敏剂输送到病灶部位，提高光敏剂在肿瘤部位累积，一定程度上可提高疗效。然而由于肿瘤复杂的微环境，如胞内高表达的谷胱甘肽（GSH）会还原光敏剂产生的活性氧（ROS），降低ROS在细胞内的累积，从而限制了PDT的效率。采用改变肿瘤细胞内氧化还原平衡状态，如使用还原敏感键等消耗细胞内的GSH，可以达到提高光敏剂产生ROS净含量的效果。此外，由于肿瘤发生机制和作用靶点的多样性，单一方式治疗难以抑制肿瘤的生长，免疫治疗作为一种新型的治疗方式因其较好的治疗效果得到了广泛的关注，然而由于免疫抑制微环境的通常造成免疫疗效较低，如PD-L1抗体的有效治疗率低于20%。因此，越来越多的基于联合治疗的方法应运而生，为提高肿瘤的疗效提供了新的方向。基于此，本课题构建了可调控肿瘤细胞内氧化还原微环境提高光敏剂产生ROS的效率，且能改善免疫抑制微环境的载体系统，实现增强光动力诱发的免疫治疗，提高抗肿瘤效果。系统的研究了该载体系统的理化性能及体内外抗肿瘤效果。具体的研究工作如下： （1）首先以Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸（Lys（Bz））为原料通过闭环反应合成Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸内酸酐单体（Lys（Bz）-NCA），再利用胱胺引发Lys（Bz）-NCA单体的开环聚合合成d-ss-PLLys（Bz），最后经氢溴酸脱去苄氧羰基保护制备得到氧化还原敏感的聚赖氨酸（d-ss-PLLys）。采用缩合反应将光敏剂二氢卟吩e6（Ce6）键合到d-ss-PLLys的侧链合成功能化的两亲性聚合物（d-ss-PLLys-Ce6）；以1-甲基-D-色氨酸（DO）为吲哚-2,3-双加氧酶（Indoleamine2,3-dioxygenase，IDO）的抑制剂，采用闭环反应合成DO内酸酐单体（DO-NCA），再通过胱胺引发DO-NCA的开环反应，制备得到氧化还原敏感的DO二聚体（d-ss-DO）。核磁共振氢谱（1HNMR）、高分辨质谱（MS）和高效液相色谱（HPLC）等手段对聚合物和二聚体结构进行表征，结果表明成功的合成了目标聚合物和二聚体分子，且对光敏剂和IDO抑制剂的改性不影响其分子活性。 （2）其次，以d-ss-PLLys-Ce6为聚合物载体，d-ss-DO为模型IDO抑制剂分子，通过透析法制备得到负载d-ss-DO药物的纳米内核（PCD）；进一步在PCD表面通过静电作用复合透明质酸（HA）构建具有主动靶向功能的纳米载体（HPCD）。采用透射电子显微镜（TEM）、动态光散射仪（DLS）、高效液相色谱（HPLC）等手段考察了纳米载体的粒径、电位、形貌、载药量、稳定性等。结果表明，纳米粒子的内核PCD具有球形结构、粒径为102nm、电位约50mV，且可有效的负载d-ss-DO，负载量为5.41%；包裹HA后HPCD为球形的核壳结构，粒径增加到140nm，电位从50mV降低到-20mV，且在5%葡萄糖溶液和10%血清中具有良好的稳定性。此外，考察了HPCD的酶和氧化还原响应特性，以及在溶液中的产生ROS的能力。结果表明，透明质酸酶（HAase）可诱导HPCD外层HA的降解，使粒径变小、电位升高；GSH可使HPCD中的二硫键断裂并导致内核疏松。体外活性氧结果证明HPCD具有良好的产生ROS的能力。 （3）进一步，系统对HPCD的体外抗肿瘤效果及促免疫激活的能力进行了研究。激光共聚焦、流式细胞仪等测试结果表明，HPCD可通过CD44介导进入细胞，胞内高含量的HAase酶加速HA的降解，暴露出正电荷的内核PCD，在质子海绵效应作用下促进PCD逃逸溶酶体。胞内ROS的产生和GSH含量测试结果说明，近红外光（NIR）激发可促进HPCD产生ROS且HPCD可通过消耗胞内GSH，破坏氧化还原平衡，进一步增强胞内ROS的含量。MTT和细胞凋亡的结果进一步证明HPCD的抗肿瘤效果优于HPC。免疫原性细胞死亡（ICD）相关因子检测表明，相比于HPC，HPCD可触发更多的CRT暴露、HMGB1和ATP的释放，进而表现出诱导机体产生免疫应答的潜力。胞内IDO酶活性抑制测试结果说明HPCD可有效的抑制胞内IDO酶活性，进而减少免疫抑制微环境的影响。RNA测序结果说明HPCD光照后对凋亡通路有明显的影响，同时也明显下调了氨基酸合成和糖酵解通路，降低肿瘤生长所需的物质和能量供应。 （4）最后，考察HPCD光动力联合免疫治疗的体内抗肿瘤效果。以乳腺癌细胞（4T1）为模型，构建小鼠皮下肿瘤模型。体内抗肿瘤效果表明，在NIR激发下，HPCD组的抗肿瘤效果明显优于HPC组，这主要是由于载体中二硫键耗竭了胞内GSH从而增强了PDT效果；此外，HPCD杀死肿瘤细胞的同时，激发免疫原性死亡通路，促进树突状细胞（DC）成熟，进而产生具有杀伤性的CD8+T细胞；同时，IDO抑制剂抑制了IDO酶的活性，进一步提高CD8+T杀伤性T细胞活性，从而增强机体免疫应答，实现高效的联合抗肿瘤效果。 综上，本课题通过调控胞内氧化还原平衡微环境提高ROS含量来增强PDT的策略，显著提高了抗肿瘤效果，同时增强后的PDT可有效的激活机体免疫系统，再联合IDO抑制色氨酸代谢破坏免疫抑制微环境，进一步提高机体免疫应答能力，增强抗肿瘤效果。该研究为构建通过调控肿瘤细胞内氧化还原平衡微环境纳米载体，进而增强光动力诱发的免疫治疗提供了新的思路和方法。
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