摘要
口腔颌面部肿瘤是口腔颌面外科的常见疾病。恶性黑色素瘤（Malignantmelanoma）是一种源于黑色素细胞或黑色素前体细胞的高度恶性的肿瘤，多发于皮肤、黏膜，在我国更多发于口腔黏膜，约占80%以上。恶性黑色素瘤对放射治疗和化学治疗的敏感性较差，早期易发生淋巴结及血行转移，预后较差，死亡率极高，约占皮肤癌死亡率的80%。目前首选治疗方法仍为手术治疗，但手术切除过程痛苦，术后瘢痕挛缩、创伤面大易引起患者治疗区功能障碍及心理障碍。光动力治疗（photodynamictherapy,PDT）是一种新型的肿瘤治疗策略，具有创伤小、治疗肿瘤范围广、治疗周期短、毒副作用小并能与其他治疗同期进行等优点，在口腔黏膜疾病及肿瘤治疗中应用较为广泛。PDT是用一定波长的光源照射肿瘤组织，肿瘤组织中富集的光敏剂经光激发产生活性氧（reactiveoxygenspecies,ROS），尤其是单线态氧（1O2）、超氧自由基等，这些物质具有一定的细胞毒性，会诱导肿瘤细胞凋亡，微血管损伤，肿瘤组织消退。传统有机光敏剂受限于水溶性差、稳定性差、单线态氧产率低、靶向性差等而不能广泛应用。纳米材料具有优异的理化特性、光学稳定性和生物相容性，在PDT领域的研究中大放异彩。石墨烯量子点（graphenequantumdot,GQDs）是一种新型的零维石墨烯纳米材料，在PDT、生物成像、传感及药物递送等领域均有较广的研究。双元素掺杂改性所获的GQDs（sulfur,nitrogen-codopedgraphenequantumdots,S,N-GQDs）由于超高单线态氧产率而备受关注，但其介导高效PDT的分子生物学机制尚不明确。此外，这种双元素掺杂的GQDs并不能主动靶向肿瘤组织，并且，在重复PDT过程中容易产生抗性，大大降低了其治疗效果。因此，本课题将首先探讨双元素掺杂的GQDs介导高效PDT的分子生物学机制，为其后续研究及应用提供基础。随后，对该纳米粒子进行改性，赋予其主动靶向肿瘤组织的特性，克服重复光照产生的PDT抗性，以此提高PDT效率。 研究方法：本试验通过水热法合成S,N-GQDs，以恶性黑色素瘤为疾病模型，探讨其介导高效PDT的分子生物学机制。在此基础上对S,N-GQDs进行修饰，以主动靶向肿瘤细胞，克服PDT抗性，增效PDT。研究分为以下三部分： 1、硫氮双掺杂石墨烯量子点治疗恶性黑色素瘤的研究：利用恶性黑色素瘤细胞探讨S,N-GQDs体外杀伤效率及分子生物学机制，利用裸鼠荷瘤模型观察S,N-GQDs体内抑瘤效果。首先利用高分辨率透射电镜（HR-TEM）、动态光散射（DLS）和X射线光电子能谱分析（XPS）等方法表征合成的材料。利用荧光探针观察S,N-GQDs在肿瘤细胞中定位，使用CCK-8和AnnexinV/PI细胞凋亡染色检测该材料的体外光动力治疗效果，探针法检测细胞内活性氧和游离钙离子。利用分子生物学技术检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及Caspase3的基因转录和蛋白表达水平，并对其上游信号通路（PI3K/Akt、p38/JNK）进行检测。最终建立裸鼠荷瘤模型，观察S,N-GQDs介导PDT对恶性黑色素瘤生长的抑制作用。 2、多肽修饰硫氮双掺石墨烯量子点靶向肿瘤成像及治疗的研究：为增强石墨烯量子点靶向性，减少治疗过程中对正常组织细胞的损伤，将c(RGDfC)多肽通过静电吸附结合至S,N-GQDs表面合成cRGD-GQDs。利用HR-TEM、紫外吸收、DLS和XPS等方法表征cRGD-GQDs，利用紫外/可见光分光光度计、稳态瞬态荧光光谱仪及酶标仪检测cRGD-GQDs的光学特性。采用流式细胞术和探针法检测cRGD-GQDs是否能够主动靶向肿瘤细胞并观察其细胞内定位，通过CCK-8和AnnexinV/PI细胞凋亡染色检测该材料的体外光动力治疗效率，利用分子生物学手段验证其介导PDT的机制，通过小动物活体成像观察其是否能够主动靶向恶性黑色素瘤，并利用裸鼠荷瘤模型检测其体内抑瘤效果。 3、多肽修饰硫氮双掺石墨烯量子点克服光动力治疗抗性及其机制的研究：通过重复PDT建立PDT抗性细胞系，通过CCK-8法计算细胞活性及其抗性系数，使用流式细胞术检测细胞内的纳米粒子、探针标记活性氧的方法证实重复PDT后抗性的产生及克服。利用分子生物学技术检测细胞凋亡相关基因转录、蛋白表达情况，检测PDT抗性相关基因转录、蛋白表达（Nrf-2、HO-1、ABCG2、NQO-1）情况及其上游信号通路（PI3K/Akt）的表达情况。 研究结果： 1、XPS显示成功合成了S,N-GQDs，TEM及DLS显示其粒径约10-20nm。荧光光谱显示其最佳激发波长λex=420nm，最佳发射波长λem=620nm，1O2量子产率ΦΔ=0.95，且在酸性环境中仍能维持稳定。S,N-GQDs能够自主入胞，光照条件下能诱导活性氧产生和游离钙离子释放。CCK-8和AnnexinV/PI细胞凋亡实验结果显示S,N-GQDs在较低浓度和光照强度下即可诱导大部分细胞凋亡，证实S,N-GQDs介导PDT具有较强的抗肿瘤作用。qPCR和蛋白质免疫印迹结果显示低浓度S,N-GQDs介导PDT过程中，促凋亡相关基因转录及蛋白表达增多，抗凋亡基因转录及蛋白表达减少，PI3K/Akt信号通路被抑制，p38/JNK信号通路被激活。裸鼠荷瘤试验结果表明，S,N-GQDs介导的PDT能够有效抑制肿瘤生长，而单纯给予S,N-GQDs或光照则不能抑制肿瘤生长。 2、紫外吸收及能谱图显示成功合成了cRGD-GQDs，TEM及DLS显示其粒径约30-40nm，其激发波长范围广，最佳激发波长λex=420nm，最佳发射波长λem=620nm，且在酸性环境中仍能维持稳定。该纳米粒子能够靶向A375恶性黑色素瘤细胞，自主定位于线粒体及溶酶体，低光密度光照条件下能够产生大量活性氧，诱导细胞内游离钙离子释放，抑制肿瘤细胞中异常激活的PI3K/Akt信号通路、激活p38/JNK信号通路，打破Bcl-2家族蛋白平衡，激活caspase酶联反应，高效诱导肿瘤细胞凋亡。裸鼠荷瘤试验结果表明，cRGD-GQDs介导PDT能够有效抑制体内肿瘤生长，并且抑瘤效果明显优于S,N-GQDs介导PDT，单纯给予cRGD-GQDs或光照则不能抑制肿瘤生长。此外，cRGD-GQDs介导PDT对小鼠重要脏器无明显损害。 3、S,N-GQDs介导的重复PDT使得恶性黑色素瘤细胞A375产生PDT抗性，S,N-GQDs的IC50从36.12nM升高至80.78nM，抗性系数约为2.24。流式细胞术结果显示，重复PDT后A375细胞中S,N-GQDs浓度明显降低，而cRGD-GQDs在重复治疗中能够维持细胞中较高浓度。CCK-8结果显示，cRGD-GQDs介导PDT对普通A375细胞和抗性A375细胞均有明显抑制作用。蛋白质免疫印迹及qPCR结果显示，cRGD-GQDs在重复治疗中能够持续抑制PI3K/Akt信号通路，抑制泵蛋白ABCG2表达，抑制Nrf2/HO-1轴，克服单纯S,N-GQDs重复光动力治疗诱导的光动力治疗抗性。体内实验结果显示cRGD-GQDs能有效抑制恶性黑色素瘤的生长，并在重复治疗中未出现复发。 综上所述，本课题证实S,N-GQDs是一种高效光敏剂，与有机光敏剂相比，它能够在较低浓度及光照强度下抑制肿瘤细胞中异常激活的PI3K/Akt信号通路，激活促死亡信号通路p38/JNK，诱导Bcl-2家族蛋白表达失衡，增加线粒体膜通透性，引发细胞色素C等凋亡因子释放，激活Caspase家族蛋白，从而诱导细胞凋亡。此外，cRGD-GQDs保持S,N-GQDs较高的1O2产率，并能够主动靶向整合素αvβ3阳性表达的恶性肿瘤细胞，持续有效抑制PI3K/Akt信号通路，高效诱导线粒体介导的肿瘤细胞凋亡，防止细胞存活。与此同时，cRGD-GQDs能够抑制泵蛋白表达，减少光敏剂外排，并抑制Nrf2/HO-1轴，维持细胞氧化应激水平，从而克服光动力治疗抗性。因此，我们认为S,N-GQDs极高的PDT效率可能是由于其较高的1O2量子产率及其对PI3K/Akt信号通路的有效抑制，该机制为纳米光敏剂的研究开发及临床应用提供了基础。本研究也提出一种使用多肽修饰纳米粒子获得主动靶向能力的策略，并能够克服重复治疗过程中产生的PDT抗性，有效抑制肿瘤生长，具有深入研究意义及一定的临床价值。
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