摘要
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种神经退行性疾病，主要发病机制为淀粉样前体蛋白APP经β-分泌酶（主要为BACE1）异常裂解后，产生不溶性Aβ42聚集并产生神经毒性的过程。AD 的主要特征为严重记忆与认知的障碍，并可能伴随着性格异常、消化系统以及胃肠道功能障碍等一系列并发症，为病人的生活带来精神和经济负担。截止2019年，我国约有1000万名AD患者，随着人口老龄化，AD人口还会进一步攀升。AD 的发病来源主要有遗传和以膳食为代表的环境因素，目前在临床上尚无彻底治疗AD的药物和手段。研究发现，以高脂高蛋白膳食为主要特点的西方膳食模式会导致AD的发生。膳食蛋白来源广泛，对人体健康的影响各不相同，而关于不同膳食蛋白对于高脂膳食所引起的AD的影响却知之甚少。因此，改变蛋白的种类和含量可能会成为预防/减缓AD发病的方法之一。鉴于此，本课题利用动物模型和细胞模型等手段，探究了不同种类（酪蛋白、鸡肉蛋白和猪肉蛋白）和含量（20%和 40%）的膳食蛋白在高脂膳食的条件下，对海马体中 APP 表达和分解的调控作用及机制。具体研究如下： 1.高脂高肉蛋白膳食对海马体APP表达的影响 为探究不同种类和含量蛋白在高脂条件下对海马体 APP 表达的影响，以 Wistar大鼠为对象，饲喂其不同种类（酪蛋白、鸡肉蛋白和猪肉蛋白）和含量（20%和40%）蛋白的高脂膳食 12 周，采集海马体。对大鼠海马体体积、炎症因子（IL-6、IL-1β、TNF-α 和 LPS）和神经递质 GABA 以及代谢物（谷氨酸、肌酸、肌醇、N-乙酰天冬氨酸和胆碱）的含量、APP、BACE1、星形胶质细胞蛋白（SCNA、P2X7、GFAP 和Caspase3）、谷氨酸能系统（GLT-1、GLAST和NMDA）和神经递质BDNF的基因表达进行了测定。结果表明，在高脂膳食的条件下，高蛋白显著上调了大鼠海马体中的GLT-1和GLAST的mRNA水平（Plt;0.05），下调了代谢物、BDNF和GABA的含量（Plt;0.05）。在高蛋白组中，与酪蛋白相比，鸡肉蛋白显著上调了海马体中的炎症水平和APP、BACE1的mRNA水平（Plt;0.05）。因此，过量摄入鸡肉蛋白上调了海马体APP的表达，并促进了高脂膳食引发的与AD相关的神经变化。 2.高脂高肉蛋白膳食对肠神经系统及N2a细胞中APP表达的影响 以Wistar大鼠为对象，饲喂其不同种类（酪蛋白、鸡肉蛋白和猪肉蛋白）和含量（20%和 40%）蛋白的高脂膳食 12 周，采集血清和十二指肠。测定血清中的炎症因子（IL-6、IL-1β、TNF-α和LPS）含量，对十二指肠上皮形态进行了表征，并测定了肠组织中炎症因子、神经递质（乙酰胆碱、谷氨酸和GABA）含量、营养物质转运体（CD36、FATP4和B0AT1）以及肠神经细胞蛋白（GFAP和S100β）的表达。同时，将膳食蛋白和胶原蛋白、肌球蛋白的消化产物对神经细胞N2a进行干预，探究不同膳食蛋白消化产物对神经细胞中APP、BACE1和GLT-1蛋白水平的影响。结果表明，在高脂膳食条件下，高蛋白膳食显著上调了FAPT4和B0AT1的mRNA水平（Plt;0.05），下调了VIP的mRNA水平（P lt; 0.05）。在高蛋白组中，与酪蛋白相比，鸡肉蛋白膳食显著上调了血清和十二指肠的炎症水平（Plt;0.05），抑制了肠神经细胞的活力，下调了神经递质乙酰胆碱的含量（Plt;0.05）。在鸡肉蛋白膳食消化产物作用下，N2a细胞中的APP和BACE1表达量和蛋白浓度呈现正相关，而酪蛋白和猪肉蛋白组呈现相反的趋势，推测可能和消化产物的氨基酸组成有关。因此，高脂条件下，鸡肉蛋白的过量摄入，抑制了Wistar大鼠的肠神经系统，而“肠-脑轴”可能是膳食上调APP表达的一条重要途径。 3.高脂高鸡肉蛋白膳食对APP/PS1小鼠海马体APP分解的影响 为进一步探究鸡肉蛋白膳食在高脂条件下对 APP 分解的影响，选用 AD 模型APP/PS1双转基因小鼠和野生型WT小鼠为研究对象，饲喂其高脂高鸡肉蛋白和高脂低鸡肉蛋白膳食12周。通过Morris水迷宫对小鼠的行为学进行探究，对海马体中APP分解（APP、BACE1、ADAM10和Aβ42）、谷氨酸能系统（GLT-1、GLAST和NMDA）、神经突触蛋白（SCNA和PSD95）相关基因水平、神经递质（谷氨酸和GABA）含量以及血清代谢组学进行了测定。结果表明，在高脂膳食条件下，高水平的鸡肉蛋白加剧了APP/PS1小鼠的记忆损伤，上调了BACE1的mRNA水平和Aβ42含量（Plt;0.05），而在野生型WT小鼠中未观察到显著影响（Pgt;0.05）。在APP/PS1小鼠中，高脂高鸡肉蛋白显著下调了SCNA、GLT-1、GLAST和NMDA的mRNA水平（Plt;0.05），上调了p38 MAPK、MKK和MLK3的mRNA水平（Plt;0.05）。血清代谢组学表明，在APP/PS1 小鼠的高脂高鸡肉蛋白和高脂低鸡肉蛋白组间对比中，鉴定出 48 个差异代谢物，主要集中在有机酸及其衍生物、脂质和类脂质分子、有机氧化合物、核苷，核苷酸和类似物、有机杂环化合物中。其中，磷酯类物质的浓度在高脂高鸡肉蛋白组APP/PS1小鼠的血清中显著下调。因此，在高脂条件下，高鸡肉蛋白促进了APP/PS1小鼠海马体中APP的分解，并抑制了APP/PS1小鼠海马体中神经元和谷氨酸能系统活力，激活了p38 MAPK通路，导致了血脂异常和脂质代谢紊乱。 4.高脂高鸡肉蛋白膳食对APP/PS1小鼠肠神经系统的影响 饲喂APP/PS1双转基因小鼠和野生型WT小鼠高脂高鸡肉蛋白和高脂低鸡肉蛋白膳食 12 周，采集十二指肠。对十二指肠形态进行观察，并测定了肠组织中肠神经细胞蛋白（GFAP和S100β）、神经递质（乙酰胆碱和VIP）以及肠组织和食糜中的氨基酸水平。结果表明，在高脂膳食条件下，高鸡肉蛋白下调了APP/PS1小鼠和WT小鼠十二指肠中谷氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸、精氨酸和天冬氨酸含量（Plt;0.05）。同时，高鸡肉蛋白显著下调了APP/PS1小鼠十二指肠神经递质VIP和乙酰胆碱的含量，上调了GABA和胆碱的含量（Plt;0.05）。相对于低蛋白组，高鸡肉蛋白组中APP/PS1小鼠和WT小鼠十二指肠有明显的绒毛破裂和萎缩现象。因此，在高脂条件下，高鸡肉蛋白抑制了 APP/PS1 小鼠十二指肠谷氨酸代谢和肠神经系统功能，并可能通过“肠-脑轴”参与促进海马体中APP分解。 5.鸡肉蛋白膳食消化产物对p38 MAPK介导的APP分解的影响 以稳定转染 APP 的神经细胞 N2a 为实验对象，给予不同浓度的（0.1，0.3，0.5 mg/mL）的鸡肉蛋白膳食消化产物24小时，通过Western blotting的方法测定APP、BACE1、GLT-1和p38 MAPK的蛋白表达量。结果表明0.5 mg/mL的鸡肉蛋白消化产物显著上调了APP转染N2a细胞中p38 MAPK，BACE1和APP的表达量（Plt;0.05），下调了GLT-1的表达量（Plt;0.05）。在APP转染N2a细胞中激活p38 MAPK后，BACE1的表达量显著上调，GLT-1的表达量显著下调（Plt;0.05）。而在鸡肉蛋白膳食消化产物干预细胞的同时抑制p38 MAPK的表达，BACE1和GLT-1表达量在APP转染N2a细胞中无显著性变化（Pgt;0.05）。因此，在APP转染的神经细胞中，p38 MAPK的激活是介导鸡肉蛋白膳食消化产物和APP分解的一条途径。
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