摘要
【研究目的】 真菌感染是全球范围内十分棘手的公共健康问题。近年来随着艾滋病患者、接受免疫抑制剂和化疗治疗的人数增多，真菌易感人群增大，侵袭性念珠菌患者越来越多。念珠菌是临床分离率最高的真菌病原体，其中最常见的念珠菌病原体是白念珠菌，然而由于抗真菌药物的使用以及气候改变，念珠菌感染物种谱发生明显变化，非白念珠菌造成的侵袭性感染也引起了广泛的关注，如“超级真菌”耳念珠菌（Candida auris）和其亲缘关系较近的希木龙念珠菌（Candida haemulonii）。耳念珠菌和希木龙念珠菌与白念珠菌一样同属CTG分支。白念珠菌酵母菌丝转换被认为是其适应宿主和毒力变化的主要原因。前期研究发现耳念珠菌可以经小鼠体内进行菌丝发育，并且证明菌丝发育是耳念珠菌普遍的生物学特征;希木龙念珠菌也被发现具有形态的多样性。本研究将深入探究影响耳念珠菌和希木龙念珠菌酵母菌丝转换的环境及分子调控机制。第一部分拟探究宿主相关的环境因子（不同碳源、小鼠器官培养基、高浓度CO2和低氧环境）对耳念珠菌酵母菌丝转换的影响;第二部分拟探究第一部分中甘油诱导菌丝发育的调控机制以及生物学意义;第三部分通过遗传筛选进一步探究影响耳念珠菌酵母菌丝转换的分子机制;第四部分通过多种宿主相关环境因子对希木龙念珠菌进行诱导，探究希木龙念珠菌的菌丝发育现象以及与希木龙念珠菌酵母形态的生物学差异。 【研究方法】 第一部分 使用低葡萄糖环境下的其他非发酵碳源、小鼠器官培养基、高浓度CC2、低氧环境对耳念珠菌的典型酵母细胞（BJCA001-Typical yeast）和菌丝细胞（BJCA001-Filament）分别进行培养，使用体视显微镜和电子显微镜对耳念珠菌的菌落和细胞形态进行观察。 第二部分 使用甘油培养基对耳念珠菌的典型酵母细胞进行培养，获取菌丝细胞的单克隆，通过再次涂布到甘油培养基验证甘油诱导的菌丝细胞是否可以稳定遗传;然后通过对菌丝细胞的基因组重测序与分析鉴定突变基因;构建突变基因的敲除质粒和回补质粒，通过酵母细胞的电转化获得敲除菌株和回补菌株;将耳念珠菌的典型酵母细胞、甘油诱导的菌丝细胞、基因突变菌株和回补菌株涂布到甘油培养基上，验证突变基因对耳念珠菌酵母菌丝转换的影响;使用小鼠皮肤定植模型探究突变菌株的生物意义;然后使用不同碳源培养基、ATP测定试剂、XTT测定试剂和线粒体压力试剂盒探究突变基因与有氧呼吸代谢和菌丝发育的关联;构建可能与突变基因功能相反的MCU1敲除菌株和回补菌株，涂板观察菌落和细胞形态，然后通过使用不同碳源培养基、ATP测定试剂、XTT测定试剂和线粒体压力试剂盒探究基因MCU1对耳念珠菌有氧呼吸代谢的作用，最后通过IP-MS和Co-IP实验验证基因MCU1在耳念珠菌中可能发挥的作用。 第三部分 首先通过使用含有PB转座子基因元件的耳念珠菌筛选获取发生菌丝发育的突变体株，接着通过对发生菌丝发育的耳念珠菌基因重测序并分析突变基因，最后使用基因功能富集分析可能参与耳念珠菌酵母菌丝转换的遗传机制;另一方面，通过分析前期耳念珠菌酵母细胞和菌丝细胞的转录组数据，结合白念珠菌中酵母菌丝转换的遗传机制，筛选出可能在耳念珠菌酵母菌丝转换中发挥调控作用的目标基因，然后构建敲除质粒或者融合片段，通过电转化获取敲除菌株，最后通过涂布观察敲除菌株与野生型耳念珠菌之间的菌落和细胞形态差异，进一步探究可能作用于耳念珠菌酵母菌丝转换的基因。 第四部分 使用不同的碳源培养基与温度条件对前期实验获得的希木龙念珠菌的pink细胞和white细胞进行诱导，观察希木龙念珠菌是否可以进行菌丝发育。然后使用Calcofluor White和DAPI染液对希木龙念珠菌的菌丝细胞进行染色，观察希木龙念珠菌的菌丝细胞与白念珠菌和耳念珠菌的菌丝细胞差异。通过不同温度下的生长曲线和菌丝形成、硫酸铜的抗逆性实验、SAP点板和大蜡螟幼虫感染实验探究希木龙念珠菌的酵母细胞和菌丝细胞的生物学区别，最后通过转录组测序分析探究可能参与希木龙念珠菌酵母菌丝转换的调控机制。 【研究结果】 第一部分 对于耳念珠菌的典型酵母细胞，甘油培养基可以诱导其进行菌丝发育，其他非发酵碳源上可以发现菌落形成sector但是未见菌丝发育，小鼠器官培养和5％CO2培养条件下未见菌丝发育，低氧环境耳念珠菌酵母细胞生长减慢;对于耳念珠菌的菌丝细胞，非发酵碳源、小鼠器官培养和5％CO2培养条件促进菌丝细胞发育，低氧环境抑制菌丝细胞发育。 第二部分 甘油诱导的耳念珠菌菌丝型细胞可以稳定遗传，对48株耳念珠菌sector基因组重测序分析发现基因BCR1突变，然后本研究成功构建耳念珠菌的敲除和回补质粒，通过电转化获得BCR1敲除和回补菌株。涂板实验观察到BCR1敲除菌株与甘油诱导的sector细胞在甘油培养基上均进行菌丝发育。小鼠皮肤定植实验证明BCR1突变菌株对小鼠皮肤的定植能力增强;非发酵碳源相对于发酵碳源促进BCR1敲除菌株的菌丝发育;ATP实验提示BCR1敲除菌株的ATP生成较多，XTT实验结果显示BCR1敲除菌株中线粒体脱氢酶活性更强，线粒体压力试剂盒显示BCR1敲除的OCR值更高，回补菌株与亲本菌株无显著差异。然后本实验成功获取可能与BCR1对菌丝发育和代谢作用相反的MCU1基因缺失和回补菌株。涂板实验发现耳念珠菌MCU1敲除菌株生长减缓且对非发酵碳源的利用缺陷，ATP实验提示MCU1敲除菌株的ATP生成减少，XTT实验结果提示MCU1敲除菌株中线粒体脱氢酶活性减弱，线粒体压力试剂盒显示MCU1敲除菌株的OCR值更低。耳念珠菌的菌丝细胞中敲除MCU1发现菌丝发育缺陷，进一步通过IP-MS和Co-IP实验发现 MCU1可能通过调控相关蛋白定位调控耳念珠菌的菌丝发育和有氧呼吸代谢。 第三部分 使用PB转座子诱导筛选菌丝型耳念珠菌，通过基因组重测序鉴定了14个参与菌丝发育的突变基因，然后通过基因功能富集分析发现细胞周期可能参与耳念珠菌的菌丝发育;然后通过分析前期耳念珠菌酵母细胞和菌丝细胞的转录组差异，结合白念珠菌中酵母菌丝转换的调控机制，从转录因子（FLO8、WOR1、NRG1）、细胞周期（HGC1）、表观遗传（组蛋白H3和LncRNA）和代谢调控（GAL4、TYE7、CIT1和SDH2）等方面选择了可能参与耳念珠菌酵母菌丝调控的基因，成功构建敲除菌株，涂板实验发现在耳念珠菌的菌丝细胞中敲除基因。涂板实验发现在耳念珠菌的菌丝细胞中敲除基因FLO8、WOR1、NRG1和HGC1，突变株的菌丝形成相较于野生型出现了小幅度增强;组蛋白H3敲除菌株未观察到明显表型，lncRNADINOR敲除菌株表现出菌丝发育和生长受限;GAL4敲除菌株未见明显表型，TYE7敲除菌株可见菌丝小幅度增强;CIT1和SDH2敲除菌株的菌丝生长显著受到抑制。 第四部分 非发酵碳源可以诱导希木龙念珠菌的pink细胞菌丝发育，其中YPG固体培养基对菌丝的诱导效果最强，高温到低温的温度切换可以诱导希木龙念珠菌的white细胞菌丝发育。Calcofluor White染色证明希木龙念珠菌的菌丝存在隔膜结构，DAPI染色证明菌丝结构多核。在25℃和30℃的培养条件下，希木龙念珠菌的菌丝细胞生长不如酵母细胞，在37℃的培养条件下，希木龙念珠菌的菌丝细胞生长受限。希木龙酵母细胞对于硫酸铜的抗逆性更强。SAP实验提示在25℃的培养条件下，希木龙念珠菌的菌丝细胞SAP活性更强，在37℃的培养条件下，酵母细胞的SAP活性更强。大蜡螟幼虫感染实验提示酵母细胞对大蜡螟的致病性更强。转录组测序结果提示菌丝特异性基因、调节菌丝发育的基因和细胞壁相关的基因在希木龙酵母和菌丝形态中存在差异表达。 【研究结论】 第一部分 宿主的环境复杂多变，本部分实验初步证明耳念珠菌可以使用宿主多变的环境条件，利用不同的营养物质;同时通过酵母菌丝转换与代谢可塑性的相互协同增强耳念珠菌对宿主的适应。 第二部分 甘油通过诱导BCR1基因突变造成耳念珠菌的菌丝发育同时增强其对小鼠皮肤的定植能力。BCR1敲除菌株在利用非发酵碳源的时候相对于发酵碳源的菌丝更强且比例更高，其中BCR1敲除菌株的有氧呼吸代谢能力增强。MCU1敲除菌株对非发酵碳源利用障碍且菌丝形成缺陷，有氧呼吸代谢能力减弱，可能是由于有氧呼吸相关蛋白定位错误。 第三部分 通过PB转座子正向遗传筛选和反向遗传操作，发现与白念珠菌酵母菌丝转换调控机制相比，细胞周期相关基因、代谢调控相关基因更加具有保守性，虽然也有像Hgc1这种在两个物种中作用不同的蛋白，但是大多数基因（如PB转座子筛选的菌丝调控基因、TYE7、CIT1、SDH2等）在耳念珠菌中发挥相似的功能;而在转录因子或者表观遗传调控酵母菌丝转换方面，耳念珠菌可能和白念珠菌具有较大的区别和差异。 第四部分 希木龙念珠菌存在菌丝发育能力。酵母细胞和菌丝细胞在菌落细胞形态、生长增殖能力、抗逆性、SAP活性、毒力和基因表达谱方面均存在差异。与大多数念珠菌不同，希木龙念珠菌可能更易造成浅部感染而不是深部感染，低温诱导菌丝生成和SAP积累，从而促进该菌在宿主皮肤定植感染。
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