摘要
作为目前公认的线粒体渗透性转换孔调节蛋白，亲环蛋白D（CypD）不仅参与调节线粒体功能，还可以调节线粒体基因的表达，与细胞的凋亡和坏死密切相关，已经成为了多种疾病治疗的一个有力靶点。包括和厚朴酚、姜黄素和淫羊藿苷在内的天然多酚类化合物具有多种药理活性，是临床上多种疾病的潜在预防和治疗药物。然而，目前已有的文献大多仅在细胞层面研究了和厚朴酚、姜黄素、淫羊藿苷以及这三种药物的衍生物与线粒体的作用，并据此推断药物可能作用于线粒体渗透性转换孔调节蛋白 CypD，关于这些药物与 CypD 的体外研究模型尚少，且缺乏药物与CypD 分子间相互作用机制的确切研究。因此，本文以 CypD 和几种天然多酚药物及其分别对应的衍生物为研究对象，利用多种光谱、分子对接以及分子动力学模拟等方法分别研究了CypD和药物之间的相互作用及机制。本论文研究内容共包含以下四个部分： 第一章：对线粒体与疾病的关联，线粒体渗透性转换孔和CypD与细胞凋亡、坏死的关系做了比较全面的介绍，综述了天然多酚类化合物的药理研究进展，综述了小分子药物与蛋白质的研究意义和研究方法，并阐明了本论文的选题背景和研究思路。 第二章：自主构建了人的CypD质粒，并进行表达纯化，得到了纯度较高、粒径均一的人CypD。利用紫外-可见吸收光谱、圆二色光谱、等温滴定量热法以及计算机模拟技术在298 K下分别研究了和厚朴酚、厚朴酚与CypD的相互作用。研究结果表明，和厚朴酚与厚朴酚在与CypD相互作用过程中均形成了相应的药物-蛋白复合物，且这两种药物在CypD上只有一个结合位点。和厚朴酚/厚朴酚与CypD的结合能力很强，其中，和厚朴酚与CypD的结合能力比厚朴酚还强。在和厚朴酚及厚朴酚与CypD的相互作用过程是焓驱动，且相互作用力主要是氢键和范德华力。和厚朴酚对CypD构象的影响比厚朴酚大，但从整体上来看，这两种药物其实不会对CypD构象造成太大的影响。比较和厚朴酚与厚朴酚的结构可知，羟基位置的不同对和厚朴酚/厚朴酚与CypD的作用能力有一定的影响。 第三章：利用荧光光谱、紫外-可见吸收光谱、圆二色光谱、分子对接和计算机模拟的方法，在298 K下分别研究了姜黄素（CUR）、去甲氧基姜黄素（DMC）和双去甲氧基姜黄素（BDMC）与CypD的相互作用。结果显示，姜黄素及其衍生物淬灭CypD固有荧光的方式是静态淬灭，它们均与CypD结合形成了药物-蛋白复合物，结合强度的顺序为双去甲氧基姜黄素＞去甲氧基姜黄素＞姜黄素，双去甲氧基姜黄素与CypD形成的复合物稳定性较高。三种化合物与CypD发生结合后会使CypD的构象发生轻微变化，其中，双去甲氧基姜黄素对CypD的构象影响相对较大。姜黄素及其衍生物与CypD结合的具体位点几乎相同，且氢键和疏水相互作用为主要作用力，位点标记实验证明这几种化合物与环孢素 A（CsA）可能存在协同作用，且与CypD结合的部位可能处于CsA结合位点的附近。姜黄素及其类似物中苯环上的甲氧基对化合物与CypD的相互作用有影响，导致这三种化合物与CypD作用的强弱不同。 第四章：通过荧光光谱、紫外-可见吸收光谱、圆二色光谱、分子对接和分子动力学模拟研究了淫羊藿苷（ICA）、淫羊藿次苷 Ⅰ （ICA Ⅰ）和淫羊藿次苷 Ⅱ （ICA Ⅱ）与CypD之间的相互作用。光谱结果显示，三种化合物通过静态淬灭方式使CypD的固有荧光淬灭，并与CypD形成1:1的药物-蛋白复合物，结合常数分别为7.10×105 M-1、1.29×104 M-1和4.79×104 M-1。分子对接结果表明，CypD形成了一个合适的空腔，可以分别嵌入淫羊藿苷及其衍生物分子，并且复合物的形成主要取决于氢键和疏水相互作用。CsA的位点标记实验也表明，淫羊藿苷及其衍生物与CypD的结合位点很可能位于CsA的结合位点附近。此外，圆二色光谱和分子动力学模拟表明三种化合物都会对CypD的构象产生一定的影响，且淫羊藿苷与CypD形成的复合物的稳定性相对较高。分析三种化合物的结构，发现糖苷取代基的位置和种类对淫羊藿苷及其衍生物与CypD相互作用的影响较大。
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