摘要
目的: 由于眼部、鼻部及口咽部在解剖学上相通，故比较中国人群健康和疾病状态下眼(Eye,E)、前鼻孔(Anterior Nares,ANs)和口咽(Oropharynx,OP)的微生物群落，揭示不同人群眼鼻咽部微生物菌群的生物学信息。从微生物学角度为眼鼻咽部疾病的发病机制、预防、诊断及治疗提供理论支持和新思路。 方法: 本研究在2021年6月至2022年10月期间，共招募48例健康志愿者、31例季节性过敏性结膜炎(Seasonal Allergic Conjunctivitis,SAC)及30例慢性泪囊炎(Chronic Dacryocystitis,CD)患者，收集下眼睑结膜囊、前鼻孔和口咽部样本。采用高通量测序技术、培养组学和菌株的全基因组测序方法相结合，对眼部及其邻近部位微生物菌群进行研究。 高通量测序技术克服了传统细菌培养的病原体少且结果受多种因素影响的局限性，可获得更多的物种信息。依据下机数据序列的相似性聚类成多个OTU(Operational Taxonomy Unit) 描述眼鼻咽部微生物群落的组成和丰度。计算Shannon指数、Simpson指数、Chao指数、ACE指数并基于Bray-Curtis相异度的主坐标分析(Principal Co-ordinate Analysis,PCoA)、欧 氏距离(Euclidean distances)的主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)综合评估眼鼻咽部微生物组群落结构的多样性、复杂性。通过构建眼鼻部理想传递模型并计算PCC(Pearson Correlation Coefficient)寻找可能在眼鼻间传递的微生物。用PICRUSt(Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States)预测菌群 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)代谢通路;通过高通量培养方式在多种培养条件下对眼鼻咽部微生物进行细菌分离培养并运用16SrRNA测序鉴定菌株;挑选眼部及其邻近部位分离的相同菌株进行毒力基因、耐药基因分析，并运用 ANI（Average Nucleotide Identity）和 Blast（Basic Local Alignment Search Tool）对近缘物种基因组相似性进行比较。 结果: （1）高通量测序结果显示健康人眼部和鼻部的微生物群落组成相似，与口咽部不同。本研究通过高通量测序技术共获得38个门，94个纲，215个目，386个科，744个属。眼部和鼻部的优势菌门是放线菌门、变形菌门、厚壁菌门，口咽部优势菌门是拟杆菌门。眼部和鼻部的优势菌属是棒状杆菌、痤疮杆菌、葡萄球菌。口咽部的优势菌属是普雷沃氏菌、阿普雷沃氏菌、嗜血杆菌、链球菌。 （2）健康人群眼部微生物菌群多样性最高，鼻部微生物菌群多样性最低，眼鼻咽三组在统计学上有明显差异（P＜0.001）。眼部是α变形菌、假单胞菌、痤疮杆菌及微小球菌富集，鼻腔是棒状杆菌富集，口咽部是拟杆菌富集。痤疮杆菌和微小球菌在眼-鼻区系之间存在生物学关联（P=0.001,0.004）。 （3）疾病组中眼部与鼻部微生物菌群存在差异。假单胞菌属是疾病组眼部的优势菌属，棒状杆菌属、葡萄球菌属仍是鼻部的优势菌属，口咽部以链球菌属为主。CD患者眼部微生物菌群多样性及F/B比值较健康组低（P＜0.001）,眼部微生物在参与代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞进程、生物体系统等功能方面与健康组有明显差异（P＜0.01）。SAC患者鼻咽部微生物菌群与健康人相似，眼部微生物菌群在参与遗传信息处理和细胞进程等功能方面与健康组有明显差异（P＜0.01）。 （4）培养组学及分离株基因组研究结果显示，眼鼻咽部分离培养获得的26个菌属和55个菌种中，眼部和鼻部表皮葡萄球菌分离率最高，口咽部唾液链球菌分离率最高。眼部和鼻部溶血性葡萄球菌基因组携带毒力基因132个，耐药基因7个。眼部金黄色葡萄球菌基因组携带毒力基因220个，耐药基因6个;鼻部金黄色葡萄球菌基因组携带毒力基因221个，耐药基因5个;口咽部金黄色葡萄球菌基因组携带毒力基因221个，耐药基因6个。眼部表皮葡萄球菌基因组携带毒力基因127个，耐药基因7个;鼻部表皮葡萄球菌基因组携带毒力基因132个，耐药基因9个;口咽部表皮葡萄球菌基因组携带毒力基因126个，耐药基因9个。ANI和Blast比较发现溶血性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌在眼鼻咽三个部位基因组相似性高。 结论: (1)健康人群眼鼻咽部的细菌具有“部位倾向性”。眼部和鼻部的微生物菌群在分类学特征和基因功能预测方面相似，而口咽部表现出与消化道菌群相似的特征。眼-鼻区系微生物菌群可通过多种途径进行生物学联系和交通，痤疮杆菌和微小球菌参与了眼-鼻区系的微生物转运。 (2)CD和SAC患者眼部微生物菌群定植物种在疾病状态下发生明显变化。提示眼部微生物菌群的失调可能与CD和SAC的发生密切相关。F/B比值指标一定程度上可以用于CD患者眼表面的炎症状态的评估。疾病状态下，鼻咽部微生物菌群的改变可能受眼部驱动。 (3)溶血性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌分别在眼鼻咽三个部位基因组相似性高、具有同源性，对眼部及邻近部位的潜在致病菌毒力基因、耐药基因的研究有临床指导意义。 (4)高通量测序技术、培养组学和单菌株全基因组测序方法相结合，可较为完整地提供眼鼻咽部微生物群落“属”、“种”水平分类学特征。建立重点菌种的培养、鉴定和全基因组信息比较技术体系，可实现眼部及邻近部位菌种的精准溯源。为今后探讨眼鼻咽部感染性疾病的发病机制、预防和新型微生态治疗提供参考。
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