摘要
目的:以人参肽(GPs)为原料,分离纯化后研究其对T2DM小鼠模型和IR HepG2细胞模型的降糖作用，并结合肠道菌群探究其与降糖之间的关联，从而为开发相关的功能性食品和临床营养科膳食干预提供理论依据。 方法:用DA201-C大孔树脂和Sephadex G15对人参肽进行分离纯化，根据国标测定人参肽的基本成分，依据文献方法测定相关活性、分子量分布、氨基酸组成。以大孔树脂纯化后的人参肽(GP)为原料，通过体内动物实验测定糖脂代谢、抗氧化、炎症因子等指标，采用16SrDNA测序和靶向代谢组学检测肠道菌群及其代谢产物短链脂肪酸，分析GP对T2DM小鼠的降糖作用，利用派森诺基因云平台分析数据。以Sephadex G15分离纯化后的人参肽(GPF1)为原料，建立IRHepG2细胞模型，采用葡萄糖氧化酶法、线粒体膜电位、彗星实验、免疫荧光等方法和抗氧化指标试剂盒测定GPF1对IR HepG2细胞葡萄糖消耗量、细胞凋亡和抗氧化的作用。用WB检测IRS-1/PI3K/Akt、AMPK信号通路及线粒体细胞凋亡信号通路中相关蛋白表达量。 结果:(1)GPs的肽含量高达80％,经大孔吸附树脂分离纯化后得到了抗氧化性和降糖活性更强的GP组分，其分子量1000 Da以下占比85％以上，并含有39.7％的疏水性氨基酸。 (2)通过建立高糖高脂饲料联合STZ诱导的T2DM小鼠模型发现，GP能够缓解T2DM小鼠“三多一少”的体征，显著降低T2DM小鼠的空腹血糖水平，改善糖耐量受损和胰岛素抵抗，显著提高T2DM小鼠肝脏中糖原含量、糖酵解关键酶（HK、PK）活力和降低糖异生关键酶（PEPCK、PBPase、G6Pase）活力（P＜0.01）;GP可以显著降低血清中FFA、TC、TG和LDL-C（P＜0.01）和显著升高HDL-C水平（P＜0.01）,改善脂代谢紊乱;GP可以显著降低肝脏中的ROS、MDA含量，提高GSH、CAT水平（P＜0.01）,改善肝脏氧化损伤，明显降低炎症因子TNF-α和IL-6水平（P＜0.05）,改善炎症反应，同时还可以明显降低AST、ALT、ALP和Cr、BUN等指标，保护肝肾功能（P＜0.05）。 （3）结肠内容物16SrDNA测序结果显示，GP-H可以调节T2DM小鼠肠道菌群紊乱。在门水平上GP-H可以降低厚壁菌门和升高拟杆菌门丰度;在属水平上，通过LEfSe分析和随机森林分析推测瘤胃球菌属、粪球菌属、Dehalobacterium、脱硫弧菌属、棒状杆菌属、异杆菌属、拟杆菌属、假单胞菌属、Odoribacter、AF12、Alitipes可能为主要的潜在糖尿病生物标志物，瘤胃球菌属和双歧杆菌属可能是GP-H发挥作用的主要降糖菌;通过靶向代谢组学分析发现，T2DM小鼠的肠道菌群代谢产物短链脂肪酸含量显著下降（P＜0.05）,以显著降低乙酸、异丁酸的含量为主，GP-H干预后显著升高（P＜0.05）,通过RDA冗余分析发现乙酸、丙酸、戊酸对肠道菌群的影响较大，且通过相关性热图发现乙酸与异杆菌属、Anaerostipes呈正相关，拟杆菌属与丙酸呈正相关，梭菌属与异丁酸呈负相关;此外，通过相关性热图发现与T2DM各指标相关性最多的菌群为双歧杆菌属，拟杆菌属、Alistipes。 （4）通过建立IR HepG2细胞模型发现，GPF1可以显著提高IR HepG2细胞的葡萄糖消耗能力（P＜0.01）,显著降低ROS水平和提高CAT活性（P＜0.01）,降低线粒体膜电位，保护DNA损伤，抑制细胞凋亡。（5）WB分析表明，GP和GPF1可以通过激活肝脏IRS-1/PI3K/Akt和AMPK信号通路，进而抑制GSK-3β的表达促进糖原合成，增加GLUT4的表达和转运提高葡萄糖的摄取，下调FoxO1、G6Pase、PEPCK的表达抑制糖异生;GP和GPF1还可以抑制Cyt-C从线粒体释放到细胞质，抑制Caspase-3、Caspase-9和Bax相关蛋白水平的提高以及Bcl-2蛋白水平的降低，从而改善肝脏糖代谢紊乱和胰岛素抵抗。 结论:（1）人参肽（GP）经过大孔吸附树脂纯化后活性进一步增强，可以通过调节T2DM小鼠的糖脂代谢紊乱、胰岛素抵抗、氧化应激、炎症反应，保护肝肾功能，改善肠道菌群紊乱进而发挥降糖作用。 (2)通过Sephadex G15对GP组分进一步分离，根据葡萄糖消耗量筛选出的最优组分GPF1,可以显著提高IRHepG2细胞的葡萄糖摄取、糖原合成、抗氧化能力和抑制细胞凋亡。 (3)GP和GPF1可以通过激活IRS-1/PI3K/Akt和AMPK信号通路调节糖原合成、糖异生和糖转运，并通过抑制线粒体凋亡信号通路改善胰岛素抵抗。
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