摘要
家蚕作为鳞翅目模式昆虫，因其产丝结茧而被广泛饲养。由于其受到长期的人工选育和驯化，其对环境波动的适应性和抗逆能力较弱。X盒结合蛋白1(XBP1)是一种内质网应激相关的重要元件。当细胞经受到外界环境的变化、细胞营养物质缺乏或自身蛋白质翻译后修饰受到影响时，会引起内质网应激，此时XBP1被激活并参与未折叠蛋白反应(UPR),促进内质网中大量特定蛋白的快速折叠和分泌，以恢复细胞内部环境稳态，保证细胞正常功能的执行。但是，如果外界应激因素持续存在，使得UPR不能恢复稳态，那么便会诱发内质网相关的凋亡途径，以消除功能无法恢复的细胞。因此鉴定家蚕BmXBP1的分子功能，为后续进一步解析家蚕在应对外界不良环境的变化的机制研究提供一定的理论基础。 首先，本研究通过分子克隆技术获得BmXBP1 (GenBank： XM_004921561.4)的序列，与KAIKObase (Load ID： BMgn002915)数据库基因序列比对一致。采用生物信息学分析，结果表明，其编码215个氨基酸残基，分子质量为24.35 kDa,等电点为9.64,亚细胞定位在内质网和细胞核中；结构域预测表明，BmXBP1包含有碱性亮氨酸拉链蛋白功能域，预期其为家蚕细胞转录因子。其次对BmXBP1进行了不同组织及发育阶段的表达特征分析。在家蚕幼虫各发育阶段中，发现蛾、卵、L1D3、L2D3期间BmXBP1表达水平显著高于其他时期。在幼虫的各组织中,该基因在中部丝腺中表达高于其他组织，表明该基因在家蚕幼虫发育早期及丝腺发育中及具有重要作用。此外，通过对汞暴露的家蚕中肠和脂肪体转录组可变剪接的数据进行分析，发现BmKBP1存在跳跃第二个外显子剪切事件。PCR测序鉴定表明BmXBP1基因在第二外显子处存在17 bp的缺失。最后基于本实验室前期构建的一体式的家蚕敲除载体的基础，进一步构建了 4个靶向家蚕BmXBP1的CRISPR /Cas9-Puro-sgRNA 一体式载体，转染家蚕BmN细胞。通过T7E1酶切及测序，获得了敲除效率较高的sgRNA,为后续进一步筛选家蚕BmXBP1基因的细胞系，鉴定其功能奠定了基础。 本研究表明， BmXBP1作为家蚕的细胞转录因子，在家蚕的各发育时期均有表达，在发育早期及中部丝腺中表达水平显著。通过对汞胁迫的脂肪体和中肠组织的转录组可变剪接数据分析，发现BmXBP1存在跳跃第二外显子剪切事件，且BmXBP1参与了内质网蛋白加工的过程。经PCR测序鉴定，发现BmXBP1缺失17bp。使用CRISPR/Cas9-Puro系统筛选到敲除BmXBP1基因效率较高的sgRNA。综上所述，基于本研究的结果，为后续进一步鉴定家蚕BmXBP1基因的功能奠定基础。
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