摘要
目的： 本研究拟利用A549和H1299两种肺腺癌细胞系建立辐射抗性细胞模型，研究YAP对NRP1转录和翻译水平的调控作用，分析在亲本细胞和肺腺癌辐射抗性细胞中的调控规律，探讨YAP/NRP1对肺癌细胞辐射抗性的影响，旨在为临床上肺癌的放疗方案提供新靶点和新思路。 方法： 1.利用大剂量分次照射的方法，建立辐射抗性（Radiarion Resistance, RR）细胞模型，分别命名为A549-RR和H1299-RR细胞。即给予2种肺腺癌A549和H1299细胞单次6 Gy照射，剂量率分别为1.02 Gy/min和0.75 Gy/min，共照射5次，总计照射剂量为30 Gy。通过克隆形成实验、细胞增殖实验、细胞形态拍照以及流式细胞术的实验方法对辐射抗性细胞模型进行鉴定。 2. 通过划痕实验，检测亲本细胞与辐射抗性细胞的迁移能力。 3. 通过细胞侵袭实验，检测亲本细胞与辐射抗性细胞的侵袭能力。 4. 通过qRT-PCR方法，检测NRP1和YAP的mRNA表达变化；在亲本细胞与辐射抗性细胞中，敲低或过表达YAP，检测NRP1的mRNA表达变化。 5.通过Western Blot方法，检测NRP1和YAP的蛋白表达变化；YAP在细胞胞质及胞核内的蛋白表达情况；在亲本细胞与辐射抗性细胞中，敲低或过表达YAP，检测NRP1的蛋白表达变化。 6. 通过免疫荧光染色法，观察亲本细胞和辐射抗性细胞YAP蛋白在细胞核内外的定位。 7. 通过分子生物学技术（基因工程），对课题组已有的空载质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-Puro进行改造，构建YAP过表达的重组质粒，并送到库美公司进行测序验证。 8. 通过瞬时转染实验，向亲本细胞和辐射抗性细胞中转染过表达或敲低YAP质粒，采用qRT-PCR和Western Blot方法验证转染是否成功。 结果： 1. 肺腺癌辐射抗性细胞模型的建立及其鉴定 （1）肺腺癌辐射抗性细胞模型的建立 用分次照射的方法对 A549 和 H1299 细胞构建辐射抗性细胞模型，剂量率1.02 Gy/min和0.75 Gy/min，每次6 Gy，重复5次，总剂量30 Gy。建成模型后，将2个细胞命名为A549-RR和H1299-RR。 （2）辐射抗性细胞模型的鉴定 利用克隆形成实验检测亲本细胞和两种辐射抗性细胞模型（ A549-RR 和H1299-RR）的放射敏感性，结果显示，当受到同等剂量照射后，辐射抗性细胞模型形成的集落数量明显高于亲本细胞，说明A549-RR和H1299-RR细胞放射敏感性均明显下降。另外，2 Gy时A549的存活分数为0.485，而A549-RR细胞的存活分数为0.733；2 Gy时H1299的存活分数为0.514，而H1299-RR细胞的存活分数为0.811。与亲本细胞相比，辐射抗性细胞模型的Dq值明显增加，说明细胞辐射敏感性减弱。因此，克隆形成实验结果说明辐射抗性细胞模型的辐射抗性高于亲本细胞，证明辐射抗性模型细胞建立成功。 2. 肺腺癌辐射抗性细胞中NRP1的变化及其影响的相关表型变化 （1）辐射抗性细胞中NRP1的变化利用qRT-PCR法检测亲本细胞和辐射抗性细胞中NRP1的mRNA水平的表达， A549-RR细胞中NRP1升高1.6倍（p＜0.01）， H1299-RR细胞中NRP1升高11.2倍（p＜0.01）。采用WB法检测NRP1蛋白水平的表达变化，与A549和H1299细胞相比，A549-RR和H1299-RR细胞中NRP1的蛋白水平均升高。 （2）辐射抗性细胞中迁移和侵袭的变化情况 利用鬼笔环肽染色检测细胞骨架的变化，结果显示，A549 和H1299细胞中仅有少量分散的无规则的纤维网络，在A549-RR和H1299-RR细胞中的细胞骨架蛋白在膜及核周区域显著增加。采用划痕实验检测细胞迁移能力的变化，结果显示，A549-RR及H1299-RR细胞的迁移能力显著增强。细胞骨架蛋白（F-actin）是细胞间及细胞与基质间的与粘附相关的主要蛋白，这种粘附能力对于调节细胞迁移和增殖具有重要的作用。因此当细胞辐射抗性增强时，细胞的粘附能力发生改变，进而会使细胞迁移及侵袭能力发生变化。 3. 肺腺癌辐射抗性细胞中辐射抗性相关分子的筛选及表达变化 （1）基因表达谱芯片寻找A549和A549-RR细胞中的差异基因 本研究采用基因表达谱芯片（RNA-Sequence），找寻A549和A549-RR细胞中差异表达基因。结果显示，在A549中共表达15747个基因，A549-RR细胞中共表达15920个基因，两者中有表达差异的共有基因有15126个。在这些共有基因中有表达上调、表达下调和表达不变的基因，其中上调基因有3888个，基因下调的有4067个。基因差异聚类热图显示NRP1及YAP均在A549-RR细胞中属于上调基因。利用JASPAR生物信息学网站对NRP1基因上游的转录因子进行预测，发现在NRP1基因上游有与YAP 蛋白结合的位点，且其中有7个结合率在 98%以上的位点。差异基因功能分析（GO）显示差异基因主要在与细胞质膜相关的生物过程中富集。差异基因信号通路分析（KEGG）显示，差异基因主要集中在与癌症相关的途径。根据上述结果，表明YAP和NRP1是辐射抗性形成的重要基因。 （2）验证肺腺癌辐射抗性细胞中YAP的表达变化 利用qRT-PCR实验检验辐射抗性细胞中YAP的mRNA水平表达变化。结果显示，A549-RR细胞中YAP升高2.2倍（p＜0.01），H1299-RR细胞中YAP升高 2.2 倍（p＜0.01）。利用 WB 实验对辐射抗性细胞中 YAP 的蛋白水平进行验证，结果显示，与A549和H1299细胞相比，A549-RR和H1299-RR细胞中YAP的蛋白水平均明显升高。这与芯片的结果一致。 （3）在两种肺腺癌的亲本细胞及辐射抗性细胞中YAP蛋白定位的变化 采用免疫荧光染色法检测亲本细胞和辐射抗性细胞中 YAP 蛋白在细胞内的定位情况，结果显示，与A549和H1299细胞相比，A549-RR和H1299-RR细胞中的YAP蛋白入核明显增加。采用WB法对YAP蛋白入核情况进行再次验证。结果显示，WB实验得到与免疫荧光染色实验一致的结果。 4. 肺腺癌辐射抗性细胞中YAP与NRP1的调控关系 （1）构建YAP过表达质粒并验证质粒序列 利用基因工程构建YAP过表达质粒，对课题组已有的空载质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-Puro进行改构，在Xba I和EcoR I限制性内切酶之间插入YAP片段。提取人正常肺（支气管）上皮细胞（BEAS-2B）中YAP的RNA全序列，利用PCR扩增出大量YAP片段。将双酶切得到目的基因YAP片段和切开的空载质粒进行 T4连接酶连接、转化、质粒小提后，得到过表达 YAP 质粒。利用琼脂糖凝胶电泳对合成的 YAP 过表达质粒进行鉴定，结果显示，目的基因YAP片段的位置与预期结果一致。同时将重组质粒送到库美公司进行测序鉴定，结果显示，质粒样品序列与YAP序列100%匹配。综上证明YAP过表达质粒构建成功，命名为YAP OE。 （2）亲本细胞和辐射抗性细胞过表达YAP后NRP1的变化 利用瞬时转染的方法，在亲本细胞和辐射抗性细胞中转染YAP OE质粒。利用qRT-PCR和WB法检测YAP及NRP1的mRNA和蛋白的表达变化，mRNA结果显示，转染了YAP OE后，A549细胞YAP升高到4.4倍（p＜0.01），A549-RR细胞的YAP升高到8.2倍（p＜0.05），说明YAP OE转染成功。检测NRP1的变化，在 A549 细胞中 NRP1 降低到 0.8 倍（p＜0.05），在 A549-RR 细胞中NRP1增加了近1.5倍（p＜0.01）。 （3）肺腺癌的亲本细胞和辐射抗性细胞敲低YAP后NRP1的变化 利用瞬时转染的方法，在亲本细胞和辐射抗性细胞中转染 YAP 敲低质粒（pPLK/GFP+Puro-YAP shRNA），利用qRT-PCR和WB法检测YAP和NRP1的mRNA和蛋白表达变化。 5. YAP敲低或过表达能影响肺腺癌辐射抗性细胞的表型变化 利用克隆形成实验、CCK-8 实验、划痕实验、Transwell 实验检测敲低或过表达YAP后，亲本细胞及2种辐射抗性细胞的变化情况。当过表达YAP时，与空载组相比，集落形成的数量增多、细胞存活率增多、迁移和侵袭能力增强。当敲低YAP时，与NC组相比，集落形成数明显减少、细胞存活率减少、迁移和侵袭能力明显降低。 结论： 1. 两种肺腺癌细胞辐射抗性形成过程中NRP1与YAP表达显著升高。 2. 两种肺腺癌辐射抗性细胞中，YAP磷酸化减少入核明显增加。 3. 在两种肺腺癌辐射抗性细胞中YAP是NRP1的上游调控因子，且YAP与NRP1正相关。 4. 敲低YAP会逆转肺腺癌细胞的辐射抗性，提高放射敏感性。
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