摘要
产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens) 为革兰氏阳性菌,在自然界中分布广泛,主要存在于动物肠道中，是一种典型的人兽共患病病原体。目前已发现其可以产生超过十七种外毒素，其中产气荚膜梭菌ε 毒素(Clostridium perfringens ε-toxin,ETX)是迄今为止已发现的产气荚膜梭菌外毒素中最为致命的毒素之一。ETX是主要由B型和D型产气荚膜梭菌产生的致病因子，也是导致绵羊和山羊肠毒素血症的主要毒素。由ETX引起的疾病具有发病急、缺乏特效药、致死快的特点，给畜牧业造成了严重的经济损失。另外，由于ETX具有的高毒性，其也被视为潜在的生物战剂和生物恐怖剂，我国也将其列入了生物两用品进出口管制清单。因此，开展ETX治疗药物的研究对生物安全和社会稳定具有极高的价值。 近年来，纳米技术飞速发展，在医学领域的应用愈加广泛。其中膜伪装仿生纳米颗粒(Membrane-camouflaged biomimetic nanoparticles,MNPs),直接利用天然衍生的细胞膜赋予纳米粒子增强的生物界面。纳米颗粒表面包裹的细胞膜能够将其来源细胞表面的大部分生物信息与功能复制到纳米颗粒表面。这一手段不仅能使纳米颗粒具有良好的生物相容性和更长的体内循环时间，还能使纳米颗粒表面具备来源细胞膜所具有的大部分生物功能，从而使纳米颗粒能够被赋予更广泛、更复杂的诊断治疗功能。利用ETX毒素可以在细胞膜上成孔的特点，采用ETX敏感细胞的细胞膜包裹聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)纳米颗粒，制备得到的MNPs可作为长循环药物，中和动物体内的ETX毒素，从而用于致命ETX毒素中毒的治疗。 本研究首先利用大肠杆菌表达系统表达了 N端带有GST标签的重组ETX毒素(GST-ETX),经过GST标签亲和纯化柱纯化，将所得蛋白超滤浓缩后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定了纯化后蛋白的纯度，并通过BCA法测定其浓度，稀释至合适浓度后保存于4℃或-20℃备用。 其次通过乳化溶剂蒸发法制备PLGA纳米颗粒，并通过优化组分比例，制备得到了符合预期的直径在100 nm左右的纳米颗粒，通过差速离心法分离不同大小的颗粒。提取犬肾上皮细胞(Madin-Darby canine kidney,MDCK)以及成熟人红细胞(Red blood cells,RBC)的细胞膜，分别通过机械挤压方式使其包裹在上述PLGA纳米颗粒表面。使用纳米流式仪(Flow NanoAnalyzer)、动态光散射仪(Dynamic Light Scattering,DLS）和透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope,TEM）对所得纳米颗粒和膜伪装纳米颗粒的物理性质进行表征。 然后利用MDCK细胞模型和RBC模型，通过细胞活性检测（MTS法）和红细胞溶血实验，分别评价GST-ETX、聚合物纳米颗粒（Polymeric Nanoparticles,NPs）和两种MNPs的体外细胞毒性、体外溶血活性。同时，利用MDCK细胞模型和RBC模型分别评价两种MNPs体外中和GST-ETX并保护敏感细胞的能力。并通过高内涵成像系统，检验两种MNPs体外保护MDCK细胞的能力。 最后以BALB/c小鼠为动物模型，分别评价GST-ETX、NPs和两种MNPs的动物毒性，并基于两种MNPs的安全性对其进行选择。之后以BALB/c小鼠为动物模型，通过治疗实验、血液生化分析以及病理组织学方法评价MNPs在小鼠体内治疗ETX中毒的能力。通过动物组织体外成像实验验证MNPs与GST-ETX在小鼠体内的代谢及相互作用。而后使用上述实验方法，分别评价静脉注射和肺递送MNPs对小鼠吸入性ETX中毒的治疗效果能力，以及提前注射或吸入MNPs为小鼠短期预防ETX中毒的能力。 本研究成功表达并获得了高纯度的GST-ETX,其毒性与天然ETX毒性相当。通过优化制备方案，成功制备了直径在100 nm左右且大小均一的PLGA纳米颗粒。通过提取不同来源的细胞膜，包裹在PLGA颗粒上制备了两种不同的MNPs,并且获得了两种MNPs的物理表征参数。体外评价结果表明红细胞和MDCK包裹的MNPs通过中和环境中的ETX,可以保护细胞抵抗完全致死浓度ETX的攻击，MDCK-MNPs的保护效果优于红细胞-MNPs的保护效果，其保护能力的高低与膜来源细胞对ETX的敏感程度正相关。 在本研究后续的两种MNPs的体内安全性评中，与来自有核细胞的细胞膜（如MDCK细胞）相比，更简单的细胞（如RBC）的细胞膜不会诱导动物产生任何免疫反应，使得用相应的细胞膜伪装的纳米颗粒在安全性方面具有优势，MDCK细胞膜能引起小鼠的超敏反应导致部分小鼠死亡。在MNPs的动物治疗评价中，确认了红细胞膜包裹的MNPs通过静脉注射和肺递送都是安全的，且都具有治疗相应的无完全致死剂量的ETX中毒的能力。此外，还发现MNPs可以改变ETX在体内不同器官之间的生物分布，被捕获的ETX不再大量进入对其敏感的肾脏和脑，而是跟随MNPs在体内移动被安全地输送到肝脏和脾脏中进而被分解，从而实现对毒素的快速清除。这为阐明MNPs治疗毒素中毒的具体机制提供了参考。最后，提前将MNPs分别通过静脉注射和肺递送两种方式递送至动物体内，均可以给动物提供最长三天的保护，表明MNPs作为长循环药物能够在长时间预防ETX中毒或提供长效治疗。 综上所述，膜伪装仿生纳米颗粒平台具有发展成为新型ETX治疗药物的潜力，并且MNPs可以通过静脉注射和吸入两种方式安全有效的治疗或预防ETX中毒。本研究为关于MNPs的细胞膜选择和治疗途径提供了新的见解，也为使用纳米颗粒提供长周期保护以预防中毒提供了新证据。
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