摘要
大豆[Glycine max (L.) Merr.]是人类生活必须的粮食作物和油料作物，大豆病害频繁发生严重影响大豆的产量和品质。选育抗病品种是防治病害最有效的手段，但传统育种方法面临周期长、抗源匮乏、病原菌毒力变异易导致抗病性丧失等问题。利用抗病基因工程提高大豆广谱抗病性是解决这一问题的有效方法之一。本研究利用农杆菌介导的遗传转化技术，在大豆中异源表达烟草模式识别受体基因RXEG1，获得3个抗立枯丝核病原菌的大豆转基因株系。同时在大豆中建立了高效的基因编辑体系，并利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了感病基因敲除突变体。主要研究内容如下： 1. 在大豆中过表达烟草模式识别受体基因 RXEG1 显著增强大豆对立枯丝核病原菌的抗性 RXEG1 是烟草中特异识别病原相关模式分子 XEG1 的模式识别受体，是植物防卫反应的关键因子。为提高大豆对根腐病的抗性，本研究利用农杆菌介导的遗传转化技术，以Williams 82大豆基因型为受体，实现烟草模式受体基因RXEG1在大豆中的稳定表达。通过叶片涂抹草甘膦、PCR 以及实时定量 PCR 的方法进行检测共获得 3个独立遗传的 RXEG1 稳定表达大豆转基因株系。通过下胚轴接种实验发现，与野生型相比，转基因材料对立枯丝核病原菌的抗性显著增加。 2. 成功建立大豆基因编辑体系 为了建立大豆基因编辑体系，我们首先对大豆毛状根转化系统进行优化，并利用该体系验证不同的基因编辑系统在大豆中的编辑效率，同时建立大豆CRISPR/LbCpf1多基因编辑体系，实现染色体大片段的删除。此外，本研究以大豆感病基因GmTAP1为靶标，利用农杆菌介导的遗传转化通过CRISPR/Cas9技术对其进行基因敲除。主要结果如下： 1) 建立快速高效的大豆毛状根转化系统。从萌发时间、共培养培养基种类、筛选剂浓度三方面对转化体系进行优化。结果表明，将萌发1d的大豆子叶在1/2 B5培养基中进行农杆菌侵染和共培养，并在生根培养基中加入 3 mg/L 的除草剂筛选，转化效率最高，达到69%。优化后的大豆毛状根转化系统，整个过程仅需16d，并广泛适用于不同大豆基因型。同时该系统可作为大豆高通量基因功能分析的有力工具，可应用于观察蛋白表达、亚细胞定位和验证蛋白-蛋白互作，以及实现基因编辑效率的评估测定。 2) 建立大豆 CRISPR/LbCpf1 多基因编辑体系。本研究利用大豆 U6 启动子驱动的crRNA array构建CRISPR/LbCpf1载体，对直接重复序列(DR)和引导RNA长度进行优化。结果表明，21nt DR和22nt guide RNA组合显示出最高的编辑效率，编辑效率达91.7%。进一步将多个DR和crRNA串联，构建CRISPR/LbCpf1多基因编辑体系，实现了8个靶标同时编辑，编辑效率达17.1%。研究发现，LbCpf1具有位点偏好性，更加偏好crRNA array中的第一个和最后一个crRNA。与CRISPR/Cas9系统相比， CRISPR/LbCpf1 在 PAM 位点远端-3rd-41rdbp 范围内均能产生编辑。利用优化的CRISPR/LbCpf1多基因编辑体系，对大豆FAD2-A基因簇进行片段删除。结果表明， CRISPR/LbCpf1在大豆中成功地实现了染色体小片段(lt;1kb)、大片段(~10Kb)和超大片段(gt;10Kb)的删除，片段删除效率分别为12.2%、12.5%、9.5%。 3) 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得GmTAP1敲除突变体。以大豆感病基因GmTAP1为靶标基因，构建5个包含不同sgRNA的基因编辑载体。利用优化后的大豆毛状根转化系统，筛选出能够诱导高效编辑的sgRNA2载体，通过农杆菌介导的大豆稳定转化获得编辑植株，经PCR、T7EI酶切、测序分析，获得2株GmTAP1敲除纯合突变体。在上述基础上，本研究还筛选出一株Transgenic-free的GmTAP1敲除突变体，为大豆抗病育种提供了全新的种质资源。
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