摘要
目的:大多数哺乳动物的睾丸下降到阴囊内悬挂在体外，比体温低3-8℃。当阴囊温度或者环境温度超过其生理温度时，减数分裂DNA双链断裂与修复受损。目前仍不清楚温度升高是否通过影响DNA核酸内切酶Spo11表达和定位，进而诱导减数分裂DNA双链断裂与修复失衡。本研究目的是探究体温或者超过体温对睾丸Spo11(Sporulation-deficient mutants 11,Spo11)、DNA双链断裂分子标记γH2AX和DNA重组修复分子标记Rad51表达和定位的影响，为生殖细胞不耐热的分子机制提供参考。 方法:为了探究体温环境对精子发生的影响，手术构建大鼠单侧腹部隐睾模型(n=6),选择了3头自发性单侧隐睾猪。所有隐睾动物的对侧正常睾丸作为对照;隐睾大鼠分别于术后2天和14天乙醚麻醉后解剖双侧睾丸。此外环境温度和睾丸局部温度升高对睾丸Spo11的表达和定位及其诱导DNA双链断裂是否也有影响仍不清楚，构建了环境热应激(每天将公猪置于37℃环境温度3 h,连续7天)(n=3)和局部热应激(42℃阴囊加热1h)(n=3)公猪模型。未热处理的猪(n=3)作为对照。热处理后阉割取公猪的双侧睾丸。睾丸组织一部分装于冻存管存于液氮，用于提取总RNA和蛋白。一部分Bouin氏固定液固定，用于制备石蜡切片。通过Western blot、免疫组织化学染色及qRT-PCR等实验技术检测睾丸组织中Spo11、DNA双链断裂的分子标记γH2AX和重组修复标记Rad51的表达和定位。 结果:1 Western Blot结果显示:与对照组睾丸相比，2天大鼠隐睾睾丸组织中Spo11和γH2AX蛋白表达水平没有显著差异，Rad51蛋白表达水平显著降低(p＜0.05)与环境热应激组结果一致;局部热应激睾丸组织中Spo11蛋白表达水平显著升高(p＜0.05),Rad51和γH2AX的蛋白表达水平显著降低(p＜0.05);14天大鼠隐睾睾丸组织中Spo11的蛋白表达水平显著升高(p＜0.05),Rad51和γH2AX蛋白表达水平显著降低(p＜0.05);猪自发性隐睾睾丸组织中Spo11蛋白表达水平没有明显差异，Rad51和γH2AX蛋白表达水平显著降低(p＜0.05)。 2 免疫组织化学结果显示: (1)大鼠和猪正常睾丸组织生精小管内可见各级生精细胞，Spo11和RAD51定位于初级精母细胞的细胞核，γH2AX免疫阳性着色可在初级精母细胞细胞核被观察到。 (2)2天大鼠隐睾与环境热应激睾丸组织中观察到初级精母细胞和圆形精子细胞数量减少，免疫组织化学结果相似。与对照组睾丸相比，初级精母细胞细胞核Spo11和γH2AX免疫阳性着色无明显差异，Rad51免疫阳性着色较弱。 (3)局部热应激睾丸组织生精小管内观察到精原细胞、少数初级精母细胞和精子细胞。与对照组睾丸相比，初级精母细胞细胞核Spo11、Rad51和γH2AX免疫阳性着色较强。 (4)14天大鼠隐睾与猪自发性隐睾睾丸组织中，除精原细胞和少数初级精母细胞外均未见减数分裂后生精细胞，免疫组织化学结果相似。与对照组睾丸相比，初级精母细胞细胞核Spo11免疫阳性着色较强，未见Rad51和γH2AX免疫阳性细胞。 3 qRT-PCR结果显示:与对照组睾丸相比，2天大鼠隐睾睾丸组织中Spo11和Rad51 mRNA表达水平均显著降低;环境热应激睾丸组织中Spo11 mRNA的表达水平没有显著变化，Rad51 mRNA的表达水平显著降低;局部热应激睾丸组织中Spo11 mRNA的表达水平显著升高，Rad51 mRNA的表达水平显著降低;14天大鼠隐睾和猪自发性隐睾睾丸组织中Spo11和Rad51mRNA表达水平均显著降低。 结论:2天隐睾与环境热应激对Spo11和γH2AX蛋白表达水平没有显著影响，下调Rad51表达水平，提示DNA双链断裂后修复受损;局部热应激上调初级精母细胞Spo11、Rad51和γH2AX表达水平，提示DNA双链断裂增加;14天隐睾与自发性隐睾上调Spo11蛋白表达水平，下调Rad51和γH2AX表达水平，提示DNA双链断裂减少。
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