摘要
作为红曲霉次级代谢产生的天然食用色素，红曲色素具有抗菌、抗氧化、降血脂等多种生物学活性，在肉制品、面制品、调味品等行业极具商业前景。由于代谢系统复杂，红曲霉发酵产色素易受外界条件干扰，难以对发酵进行有效调控以提高红曲色素的产量。基于此，本课题旨在采用代谢组和加权基因共表达网络分析相结合的系统生物学方法对红曲霉发酵产红曲色素的代谢调控机制进行解析，寻找能提高红曲色素产量的潜在靶点和途径，进而对红曲霉发酵产红曲色素的代谢进行定向改造。 （1）微调红曲霉的液态发酵条件，对红曲霉发酵过程进行代谢扰动。首先，使用基础发酵培养基对红曲霉进行发酵培养。结果发现，发酵60 h是区分不同红曲色素生物合成的关键观察点。因此，将发酵60 h作为对红曲霉实施代谢扰动的采样点。向基础发酵培养基中分别额外添加17种氨基酸对红曲霉进行代谢扰动，结果显示， R1、R2、Y1、Y2、O1、O2六种主要红曲色素的变异系数均处于0.3459和0.6397之间，表明代谢扰动引起的红曲霉表型变异为中等，尚未导致其代谢崩溃。然后采用基于UHPLC-MS的代谢组学技术进行采样，共分离和鉴定出68种代谢物，将所有代谢物丰度作为自变量，六种色素作为因变量，进行WGCNA分析，找到与色素合成显著相关的模块中关键代谢物富马酸和苹果酸，且两者均属于三羧酸循环中的重要代谢物。 （2）随后，外源添加关键代谢物对三羧酸循环进行代谢扰动验证。实验结果表明，添加0.05 g/L富马酸、苹果酸和草酰乙酸后有利于提高红色素产量和菌体量，红色素产量相当于对照组的1.18倍、1.19倍和1.15倍，加入富马酸后菌体量提高了37.1%。富马酸和苹果酸的添加促进了更多橙色素转化为黄色素，说明添加关键代谢物对调节红曲霉发酵产红曲色素的有效性。 （3）考察了添加富马酸、苹果酸、草酰乙酸后细胞内NAD(P)+、NAD(P)H、ATP的生成情况。结果显示，苹果酸组和草酰乙酸组NADH/NAD+分别是对照组的1.3倍和2.2倍。实验组NADPH/NADP+的比值均高于对照组，尤其是苹果酸组和草酰乙酸组的NADPH/NADP+分别是对照组的11倍和15倍。与对照组相比，添加0.05 g/L富马酸和苹果酸后，ATP的浓度分别提高了112%和158%，表明通过三羧酸循环调节细胞内氧化还原状态的可行性。 （4）通过RT-qPCR，分别检测了外源添加富马酸、苹果酸、草酰乙酸后红曲色素合成基因簇的表达量。结果表明，编码氧化还原酶基因的表达发生了很大的变化，富马酸和苹果酸组的MpigC表达下调，而草酰乙酸组的表达上调；实验组的MpigF和MpigN的表达均上调；苹果酸和草酰乙酸组的MpigH上调，富马酸组的表达倍数变化不明显。上述结果表明，本研究条件下，基因簇的表达不是红曲色素合成过程中的限制因素。 总之，本研究通过对红曲霉发酵过程进行代谢扰动，联合WGCNA分析鉴定了影响红曲色素合成的关键途径三羧酸循环和中枢代谢物富马酸和苹果酸，并通过理性添加策略实现了对红曲霉发酵产红曲色素的定向改造，研究成果将为红曲霉液态发酵生产色素提供理论指导。
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