摘要
鸡球虫病是一种在雏鸡中感染率和病死率都很高的寄生虫病，严重者死亡率可高达80％。免疫鸡球虫病活疫苗可减少该病引起的肠道病变和降低死亡，但雏鸡在免疫期间的增重减缓。为进一步提高鸡球虫病活疫苗的免疫效果，降低疫苗的副作用，将鸡白细胞介素 4(chicken interleukin-4,ChIL-4)和鸡白细胞介素 2(chicken interleukin-2,ChIL-2)融合基因导入食品级外源蛋白表达系统L.lactis NZ3900/pNZ8149,构建可表达分泌ChIL-4-ChIL-2 融合蛋白的新型重组L.lactis NZ3900/pNZ8149-ChIL-4-ChIL-2(简称RLIL4/2)。采用PCR、细胞培养、蛋白质免疫印迹、酶联免疫吸附试验、RT-qPCR、H.E.染色、α-醋酸萘酯酶染色、甲基绿派洛宁染色、免疫荧光染色、16SrDNA二代测序及动物免疫攻毒试验等方法，研究重组L.lactisNZ3900/pNZ8149-ChIL-4-ChIL-2分泌的蛋白产物生物活性及对鸡球虫病活疫苗的增效作用、增效机制、实验室安全性等。试验结果表明: (1)成功构建了重组L.lactis NZ3900/pNZ8149-ChIL-4-ChIL-2,上清液和菌体均可检测到目的蛋白;经诱导的RLIL4/2上清液可显著增强经ConA或LPS活化的原代鸡脾脏淋巴细胞的增殖活性(P＜0.05)。表明，RLIL4/2可表达分泌ChIL-4-ChIL-2融合蛋白，且在体外促进鸡脾淋巴细胞的增殖活性。 (2)SPF雏鸡口服RLIL4/2后1～7天，经组织匀浆富集培养和PCR检测发现，各肠段均有菌体定植，且以小肠为主(十二指肠＞空肠＞盲肠)。通过粪便富集培养和PCR检测，发现RLIL4/2在口服7天后从鸡肠道排空。 (3)SPF鸡在4日龄和14日龄分别以1×107CFU/羽～1×1011 CFU/羽的RLIL4/2与鸡球虫病活疫苗共接种，于28日龄攻毒。各接种组10只鸡的十二指肠、空肠和盲肠病变记分均≤1;1×109CFU/羽和1×1010CFU/羽RLIL4/2+疫苗接种组实验鸡的平均增重均显著高于仅疫苗接种组(P＜0.05),卵囊相对减少率均大于95％,各肠道病变记分均显著低于仅疫苗接种组(P＜0.05),ACI分别为187.85和191.33,而仅疫苗接种组ACI为174.61。表明，RLIL4/2与鸡球虫活疫苗共同接种可使抗球虫效力从中效提升至高效,其中1×109CFU/羽是RLIL4/2对鸡球虫病活疫苗发挥免疫增效作用的最低有效剂量。 (4)SPF鸡在4日龄共接种RLIL4/2和鸡球虫病三价四株活疫苗，间隔5d～7d加强免疫一次，于25日龄进行攻毒。当两次免疫的间隔时间为6d、7d时，各接种组至少有8只实验鸡的十二指肠、空肠和盲肠肠道病变记分≤1，RLIL4/2+疫苗接种组实验鸡平均增重较免疫间隔时间相同的仅疫苗接种组显著升高（P＜0.05）,卵囊相对减少率均高于97％。免疫间隔时间为6d和7d时，RLIL4/2+疫苗接种组的ACI分别为171.78和183.64,达到中效和高效抗球虫效果;而仅疫苗组在间隔时间为7d的ACI为160（低效抗球虫作用）。表明，RLIL4/2与鸡球虫病活疫苗共同接种可使疫苗免疫间隔期缩短1 d。 （5）SPF鸡在4日龄和14日龄共免疫RLIL4/2和鸡球虫病三价四株活疫苗，分别于二免后第4天到第6天攻毒。各免疫组实验鸡的平均增重随攻毒时间的推迟而升高（P＜0.05）,卵囊产量则相反。二免后第6天攻毒时，仅疫苗组10只实验鸡各肠道病变记分均≤1，ACI达到160（中效抗球虫作用）;二免后第5天和第6天攻毒时，RLIL4/2+疫苗组的实验鸡各肠道病变记分均≤1,ACI分别为166.48和184.72,达到中效和高效抗球虫效果。表明，RLIL4/2与鸡球虫病活疫苗共同接种可使疫苗免疫产生期提前1d。 （6）SPF鸡在4日龄分别以0.4羽/只～1.0羽/只的鸡球虫病活疫苗和RLIL4/2共接种，14日龄加强免疫一次，25日龄攻毒。攻毒期内，RLIL4/2+疫苗组鸡的平均增重随疫苗接种剂量的降低而降低，卵囊产量增加。疫苗接种剂量在0.6羽/只～1.0羽/只范围内时，各组至少有8只实验鸡十二指肠、空肠和盲肠的肠道病变记分≤1，且ACI均大于160。表明，鸡球虫病活疫苗与RLIL4/2共同接种时，疫苗剂量下降40％仍能有效抵抗鸡球虫病。 （7）分别在4日龄和14日龄以RLIL4/2和鸡球虫病活疫苗共同接种SPF鸡，首免后第7天、第14天和第28天，与仅疫苗组相比，RLIL4/2从转录水平和蛋白水平上调了免疫相关器官和肠组织中Th1型（IL-2、IFN-γ、TNF-α）和Th2型（IL-4）细胞因子的表达，也上调了肠液中SIgA蛋白表达（P＜0.05）。首免后第7天、第14天上调主要免疫器官和肠道中T淋巴细胞、B淋巴细胞、APCs转化数量（P＜0.05）,第28天时仍能上调肠道组织中T、B淋巴细胞的转化数量（P＜0.05）。此外，检测二免后第7天鸡肠道菌群发现接种组肠道菌群种类可维持稳定，而且口服RLIL4/2可增加肠道有益菌的相对丰度（P＜0.05）,降低条件致病菌的相对丰度（P＜0.05）。试验表明，RLIL4/2可通过加强细胞免疫、体液免疫、肠道黏膜免疫应答以及增加肠道益生菌和抑制条件性致病菌的菌群，发挥其对鸡球虫病活疫苗的免疫增效作用。 （8）分别在SPF鸡4日龄和14日龄时以一次和两次单剂量（1×109 CFU/羽），一次超剂量（1×1011 CFU/羽）口服RLIL4/2,0～14天均未引起雏鸡临床异常和死亡。口服两次单剂量可提高鸡的增重（P＜0.05）,未导致鸡重要组织器官的组织病理学变化，且可增加肠道益生菌菌群（P＜0.05）。经组织匀浆富集培养和PCR检测发现，菌体不易位到心、肝、脾、肺、肾和血液。RLIL4/2仅在口服后第4天水平传播给同笼饲养的健康鸡，且未在环境样品中检出RLIL4/2。试验表明，RLIL4/2对鸡安全，不易位到肠道以外组织，水平传播和环境传播能力较差。 综上所述:本文成功构建了食品级RLIL4/2,1×109CFU/羽的RLIL4/2和鸡球虫病活疫苗共接种SPF鸡，能够增强细胞免疫、体液免疫及肠道黏膜免疫，促进APCs增殖和调节肠道菌群稳态，对鸡球虫病活疫苗具免疫增效作用。RLIL4/2将鸡球虫病活疫苗的免疫间隔时间间缩短了 1d,免疫产生期提前了 1d,降低了 40％的疫苗用量，还具有良好的安全性。
NETL