摘要
我国是甘蔗种植大国，甘蔗加工过程中副产的甘蔗渣形成量巨大，且尚未形成有效的处理或再利用途径。以甘蔗渣为原料经酶法水解释放其中的单糖用作发酵产业的碳源供给原料，是甘蔗渣实现资源再利用的重要应用方向之一，有助于提升甘蔗综合加工产业的经济效益和社会效益。选育具备直接水解利用甘蔗渣生产高附加值化学品或材料单体新菌种，将有助于甘蔗渣水解释放单糖过程的低成本高效率规模化应用。为此，本研究在实验室前期研究结果的基础上，以有效辅助甘蔗渣水解的外切葡聚糖酶（CbhC）、内切葡聚糖酶（EglA）和β-葡萄糖苷酶（BgA）为目标酶分子，以L-乳酸高产菌株为出发菌株，利用基因工程的方法构建具备上述酶分子分泌表达能力的重组大肠杆菌，并建立综合生物加工直接利用甘蔗渣混菌发酵生产L-乳酸的新工艺。本文的主要研究结果如下： （1）成功构建了表达内切葡聚糖酶（EglA）、外切葡聚糖酶（CbhC）和β-葡萄糖苷酶（BgA）的重组大肠杆菌。以课题组前期获得的携带有黑曲霉来源的外源基因的重组质粒 pPIC9K-cbhc、pPIC9K-egla 和 pPIC9K-bga 为模板，通过PCR扩增的方式克隆获得完整序列，并克隆入表达质粒pND-113的启动子PamyL和信号肽SPamyL下游，得到重组质粒pND-cbhc、pND-egla和pND-bga。并将上述重组质粒电转化入L-乳酸单体高产菌株E.coli B0013-090B中，成功构建了用于分泌表达外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和 β-葡萄糖苷酶的重组大肠杆菌090B-cbhc、090B-egla和090B-bga。 （2）重组大肠杆菌 090B-cbhc、090B-egla和 090B-bga均分别成功实现了目标酶分子的分泌表达。通过实验验证，刚果红平板上三种重组菌发酵液的点样孔周围均有明显的透明圈；以CMC-Na为底物，测定重组菌090B-cbhc、090B-egla分泌表达酶的酶活力为0.220 U/mL和0.530 U/mL；以纤维二糖为底物，测定重组菌090B-bga分泌表达酶的酶活力为0.070 U/mL。 （3）建立了甘蔗渣为原料的综合生物加工发酵新工艺，并实现了以甘蔗渣为原料直接发酵合成 L-乳酸。重组菌好氧培养产酶，090B-cbhc、090B-bga 和090B-egla的发酵液依据菌体量1：2：1的复配比例接入预处理后的甘蔗渣中进入厌氧发酵，发酵结束时乳酸的产量为 15.0 g/L，甘蔗渣到 L-乳酸的转化率为43.5%，L-乳酸合成速率为0.417 g/（L?h），较对照组B0013-090B菌株的乳酸含量提高了30.43%，建立综合生物加工利用甘蔗渣重组均混菌体系发酵产L-乳酸的新工艺。
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