摘要
目的：探讨双链RNA结合蛋白STAU1调节Pparγ2 pre-mRNA可变剪接促进脂肪细胞分化的分子机制。 方法：（1） 敲低STAU1并用鸡尾酒法诱导3T3-L1前脂肪细胞分化，RT-qPCR及Western Blot检测分化第4天Stau1, Pparγ和Pparγ2基因表达水平，BODIPY 染色观察分化第 4 天脂滴生成情况；（2）在 SVF 细胞中敲低PPARγ2的同时过表达STAU1, RT-qPCR及Western Blot检测分化第4天Stau1, Pparγ和 Pparγ2的基因表达水平，BODIPY染色观察分化第 4天脂滴生成情况；（3）取敲低 STAU1 并分化第 4 天的 3T3-L1 前脂肪细胞进行转录组学测序，分析敲低STAU1后细胞基因表达的变化。（4）根据RNA-seq数据分析不同可变剪接事件的发生频率。（5）构建Minigene剪接报告质粒分析STAU1对Pparγ2 pre-mRNA可变剪接的影响。（6）构建脂肪组织特异性敲除STAU1小鼠，分别使用普通饲料和60%高脂饲料饲养 17周，检测体重、血脂、GTT与 ITT等代谢表型，检测 iWAT组织大小，脂肪细胞面积以及 PPARγ 的蛋白表达水平。（7）分离并培养 STAU1fl/fl和STAU1Δ/adipo小鼠iWAT中的SVF细胞，分别诱导分化至第10天，在0、2、4、6、8，10天检测Stau1，Pparγ和Pparγ2的基因表达水平；两组SVF细胞中分别使用慢病毒过表达 STAU1，在诱导分化的第四天检测 Stau1，Pparγ和 Pparγ2的基因表达水平。 结果：（1）与对照组相比，在3T3-L1分化过程中敲低STAU1使脂滴生成明显减少，Pparγ2 的 mRNA 及蛋白表达明显降低，差异具有统计学意义（Plt;0.05）。（2）RNA-seq 结果显示，STAU1 对照组与敲低组基因表达存在明显差异，并且组内生物学重复之间存在明显的相关性；与对照组相比，siRNA1敲低组有 1719个基因上调，1464个基因下调，siRNA2敲低组有 2336个基因上调，有 2718个基因下调，两组有 895个基因共同上调，有 554个基因共同下调；GESA富集分析结果显示，敲低 STAU1 使 PPARγ 信号通路相关基因表达下调，差异具有统计学意义（Plt;0.05）。（3）RNA-seq结果显示，敲低 STAU1对外显子跳跃事件影响最大，在Minigene 报告质粒中插入 B1 序列明显增加了下游外显子的剪接，差异具有统计学意义（Plt;0.05），而截短插入序列使下游外显子的包含明显减少，差异具有统计学意义（Plt;0.05）。（4）与STAU1fl/fl小鼠相比，STAU1Δ/adipo小鼠iWAT中STAU1表达明显减少，而心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏与脾脏无差异；在HFD饲喂条件下，与 STAU1fl/fl小鼠相比，STAU1Δ/adipo小鼠体重增长速率较慢，体型较小，血清甘油三酯明显降低，差异具有统计学意义（Plt;0.05）；GTT 和 ITT 实验结果显示，与STAU1fl/fl小鼠相比，STAU1Δ/adipo小鼠葡萄糖耐量和胰岛素敏感性明显改善，差异具有统计学意义（Plt;0.05）；与 STAU1fl/fl小鼠相比，STAU1Δ/adipo小鼠 iWAT体积和脂肪细胞面积明显减小，PPARγ 的蛋白水平明显降低。（5）与 STAU1fl/fl组相比， STAU1Δ/adipo组SVF分化过程中Stau1和Pparγ基因表达明显降低，差异具有统计学意义（Plt;0.05）；在使用慢病毒过表达STAU1后，能够回补Pparγ2的基因表达。 结论：STAU1通过与Pparγ2 pre- mRNA中的B1序列结合，促进E1外显子的剪接，进而增强Pparγ2基因表达，促进脂肪细胞分化。
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