摘要
驯化免疫是天然免疫细胞受到初次刺激或感染后，对同源或异源的第二次刺激体现更强的反应，即天然免疫记忆。针对感染或危险信号，天然免疫细胞进行识别和应答以清除感染或危险信号，免疫反应恢复到基础水平，与此同时，天然免疫细胞发生代谢和表观遗传等中长期重编程变化，受到再次刺激后，反应性增强。灭活或亚单位等疫苗中通常需要佐剂，以增强免疫应答反应。基于驯化免疫的活化配体发现和机制的研究，将为新型佐剂和双记忆疫苗的研制奠定基础。因此，本论文通过构建驯化免疫研究模型，筛选和鉴定诱导驯化免疫的细菌产物，并分析其佐剂效应。 相对于细胞水平研究，通过监测生物体的生物反应的体内研究能从全局评价外源刺激的功能作用。大蜡螟幼虫缺少适应性免疫系统，并且天然免疫系统也与脊椎动物具有高度的结构和功能相似性，因此，本项目组探索建立大蜡螟幼虫驯化免疫研究模型。在本研究中，我们首先确定白色念珠菌种子菌体的生长曲线，进行白色念珠菌最佳感染剂量筛选，确定最佳的驯化诱导剂量和最小致死剂量。进一步我们将大蜡螟幼虫的存活率、皮肤黑化程度、活动性、虫体血淋巴荷菌作为驯化模型的评价指标。已知白色念珠菌因其细胞壁成分 β-葡聚糖而具有驯化免疫诱导作用，能增强天然免疫细胞对白色念珠菌再次感染的反应性，因此，白色念珠菌被选用为驯化免疫模型的初次刺激和再次刺激因子。大蜡螟幼虫注射不同剂量的白色念珠菌，在3 d或7 d的间隔期后，接受致死剂量白色念珠菌感染。结果显示白色念珠菌预刺激可以显著提高大蜡螟幼虫的存活率和活动性，降低体表黑化程度和血淋巴荷菌量，说明白色念珠菌诱导大蜡螟幼虫驯化免疫。 利用大蜡螟幼虫驯化免疫筛选模型，对本实验室自建的畜禽来源的共生菌进行驯化诱导活性筛选，发现粪肠球菌 WY-15 具有驯化诱导作用。进一步研究表明，粪肠球菌 WY-15 活菌及培养上清均具有驯化诱导作用。为分离获得粪肠球菌产生的驯化诱导物质，我们采用饱和硫酸铵沉淀法进行粗提，离子交换层析进行初步纯化，制备型高效液相色谱（HPLC）进行精细纯化，对获得的F4-2组分，应用MALDI-TOF/TOF质谱法进行鉴定，确定其为核糖体蛋白S11，并且确定其编码基因。利用小鼠腹腔巨噬细胞对核糖体蛋白S11进行活性分析，结果表明，核糖体蛋白S11预刺激的巨噬细胞，对第二刺激的反应性增强，包括一氧化氮释放增多，TNF-α 和 IL-6 的分泌水平提高，吞噬和杀伤金黄色葡萄球菌的能力增强。 为了提高核糖体蛋白 S11 的产量和充分验证核糖体蛋白 S11 的驯化免疫诱导作用，应用pET-28a和大肠杆菌BL21（DE3）构建重组表达体系，获得了重组核糖体蛋白S11，并且重组和纯化的具有相当的驯化诱导活性。 核糖体蛋白S11因其驯化免疫诱导特性，具有作为佐剂的潜力。通过细胞毒性实验初步分析其安全性。结果表明在有效工作浓度下，核糖体蛋白S11对小鼠腹腔巨噬细胞和 RAW 264.7 细胞没有明显的细胞毒性。体外溶血实验表明，核糖体蛋白S11对小鼠和鸡的红细胞无明显溶血现象。稳定性实验分析表明，核糖体蛋白S11具有较好的热稳定性和pH稳定性，能被胰蛋白酶和蛋白酶K水解。 以卵清白蛋白（OVA）作为模式抗原免疫小鼠分析核糖体蛋白S11的佐剂效应。与铝佐剂相比，OVA+核糖体蛋白S11组产生更高水平的OVA特异性IgG，具有显著增强体液免疫应答效果，脾组织增重明显；组织病理学染色结果表示OVA+核糖体蛋白 S11 免疫后小鼠脾组织的生发中心的大小和数量显著增加。CCK8法检测OVA+核糖体蛋白S11免疫后脾淋巴细胞增殖能力显著增强。以上结果表明核糖体蛋白S11具有成为新型佐剂的巨大潜力。 综上所述，本研究将大蜡螟幼虫应用于驯化免疫模型研究，筛选诱导驯化免疫的共生菌。驯化诱导活性物质经饱和硫酸铵沉淀、离子交换层析、制备型HPLC纯化，质谱鉴定为核糖体蛋白S11，利用大肠杆菌可成功表达具有生物活性的核糖体蛋白S11。体外安全性实验表明核糖体蛋白S11具有良好的生物安全性和稳定性。佐剂效应表明与铝佐剂相比较，核糖体蛋白S11具有增强OVA特异性体液免疫应答，因此具有作为优良佐剂的巨大潜力。
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