摘要
灰葡萄孢菌 (Botrytis cinerea) ，又称灰霉菌，是一种寄主范围十分广泛的死体营养型植物病原真菌，可侵染超过1000种寄主植物，在农业生产过程中造成巨大的经济损失。灰葡萄孢菌可侵染植物的不同器官，在各生长阶段造成危害。灰葡萄孢菌主要以分生孢子侵染寄主，分生孢子接触寄主后，受到一系列信号调控，诱导分生孢子萌发生成芽管、附着胞、侵染垫侵入宿主细胞，灰葡萄孢菌还通过分泌各类细胞壁降解酶降解寄主细胞壁、小分子毒素杀死寄主并获取营养以满足自身生长发育。尽管如此，我们对灰葡萄孢菌的致病相关因子及其如何调控该菌的致病力的认识仍有待完善。 泛素是一种高度保守的由76个氨基酸组成的蛋白质，泛素化过程是指一类分子质量较小的蛋白质通过激活酶、结合酶、连接酶和降解酶等这些特殊酶的作用，进行特异性修饰的过程。同时，在参与细胞的分化、基因表达、转录调节、信号传递和发病机制等近乎所有生命活动的调控。在灰葡萄孢的致病过程中，有许多致病相关基因参与，但目前仍有许多基因功能未知，关于泛素化蛋白UBI4在调控植物病原真菌，尤其是灰葡萄孢菌的致病发育、致病力及致病机制方面尚缺乏相关研究。 本研究重点阐析编码泛素化蛋白的BcUBI4基因在灰葡萄孢菌致病过程中发挥的作用。通过筛选本实验室构建的约含5万个T-DNA插入转化子群体，获得一株致病力致弱的突变体株 M22017 ，通过 TAIL-PCR （ thermal asymmetric interlaced PCR）即热不对称交错PCR分析发现T-DNA插入到灰霉菌基因组中编码泛素蛋白基因BcUBI4上游。为研究BcUBI4功能，本研究利用同源重组和农杆菌介导的遗传转化方法获得了灰葡萄孢菌BcUBI4基因缺失突变体ΔBcubi4-1、ΔBcubi4-2，以及回补转化子ΔBcubi4-C，致病性检测发现BcUBI4基因影响灰葡萄孢菌致病过程。通过对比分析野生型 B05.10 与 BcUBI4 基因缺失突变体菌株的生长，侵染寄主能力及逆境胁迫应答，我们发现BcUBI4基因缺失突变体在生长过程中和侵染初期表现出明显差异，具体结果如下： 1.对灰葡萄孢菌野生型、BcUBI4 缺失突变体和回补菌株进行表型分析发现相较于灰葡萄孢菌的野生型菌株和回补菌株，突变体株生长显著迟缓。同时， BcUBI4 能够调控灰葡萄孢菌的致病力，参与调控分生孢子产生、侵染垫形成、菌核形成等过程。BcUBI4 的缺失严重影响突变体在菌丝伸长、菌落形态等正常生长过程。UBI4 缺失突变体不产生分生孢子，无法形成完整侵染结构以侵入寄主植物细胞，几乎完全丧失致病力。这表明BcUBI4可能通过调控病原菌的致病相关发育过程，进而调控灰葡萄孢菌的致病力。 2. 在对BcUBI4可能参与调控灰葡萄孢菌对逆境胁迫的应答探究中，我们在CM 培养基中添加几种不同外源化合物以模拟灰葡萄孢菌受到不同的环境胁迫，其中通过添加0.005% SDS，0.01% SDS和600 μg/mL的刚果红来培养B05.10、ΔBcubi4-1、ΔBcubi4-2及ΔBcubi4-C的结果显示，BcUBI4基因缺失突变体株的生长抑制率显著高于野生型菌株和回补菌株的生长抑制率。预示BcUBI4很可能参与了灰葡萄孢细胞壁合成过程。使用外源26S蛋白酶体抑制剂硼替佐米抑制泛素介导的蛋白水解，显著抑制了灰葡萄孢菌的分生孢子萌发，结果与UBI4缺失突变体的实验表型较为一致。此外，将野生型菌株 B05.10 培养在含硼替佐米的平板培养基上，UBI4基因的表达受到了明显的抑制，进一步印证了UBI4通过参与泛素化过程调控灰葡萄孢菌的致病相关发育，进而调控其致病力。因此，本研究推断灰葡萄孢菌泛素相关调控因子BcUBI4对纤维素的合成及降解相关调控可能是其参与病原菌侵入过程的重要途径。 本研究系统解析了灰葡萄孢菌BcUBI4基因的生物学及致病力功能，研究结果有助于我们对 BcUBI4 致病相关因子在植物病原真菌中所发挥的作用的认识，同时能够靶向研究在泛素通路上BcUBI4可能发挥的作用，为防治重要植物病原真菌新药物的研发提供的潜在的新作用分子靶点，同时也为制定灰霉病防控新策略提供科学依据。
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