摘要
目的:顺铂作为一种常见的铂类化疗药物，长期大剂量的使用会引发耳毒性导致毛细胞死亡，出现听力的不可逆损伤，既往研究发现活性氧激活的自噬在顺铂化疗诱发的耳毒性中具有重要作用，因此调控自噬激活可能是防治顺铂耳毒性的潜在策略之一。肝细胞因子/细胞间质上皮转换因子（hepatocyte growth factor/cellular-mesenchymal epithelial transition factor,HGF/c-MET）信号通路在毛细胞的生长发育中发挥着重要的作用，同时在多种疾病中发现，其对自噬具有一定的调控作用。因此，本实验利用HEI-OC1细胞，探究HGF/c-MET信号通路通过调控自噬参与顺铂诱导的耳毒性的作用及其具体机制。 方法:本研究所用细胞为小鼠耳蜗毛细胞（House Ear Institute-Organ of Corti 1,HEI-OC1）;细胞增殖活性检测试剂盒（Cell Counting Kit-8,CCK-8）检测顺铂刺激 HEI-OC1 细胞的半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration,IC50）;将HEI-OC1细胞分为4组:DMEM对照组、CIS组（8 ug/ml顺铂处理）、CIS+HGF 组（8 ug/ml 顺铂和 20 ng/ml HGF（c-MET 激活剂）处理）和 CIS+JNJ组（8 ug/ml 顺铂及 20 ng/ml JNJ38877605（c-MET 活化抑制剂）处理），24 h后，利用荧光定量 PCR技术（quantitative polymerase chain reaction,q-PCR）检测各组c-MET基因mRNA表达变化，Western blotting技术检测各组中c-MET基因总蛋白及磷酸化激活状态（p-MET）的表达水平;CCK-8检测细胞增殖活性，判断c-MET蛋白激活对毛细胞增殖的影响;Western blotting技术检测LC3Ⅱ/Ⅰ的含量;LC3双荧光慢病毒转染细胞成功后，再次将细胞分为DMEM组、CIS组、CIS+HGF组和CIS+JNJ组，各组相应的处理与前述分组相同，检测各组的自噬通畅程度，判断c-MET激活对毛细胞自噬的影响;将对照组设定为无血清的DMEM-1组，实验组分组及处理与前述实验相同，利用ROS试剂盒检测各组细胞内ROS含量，探究c-MET的激活对ROS生成的影响。 结果:（1）CCK-8检测结果表明，顺铂对毛细胞增殖活性的影响具有剂量依赖性，其IC50为8.1033±0.2087ug/ml;因此，选择8ug/ml作为顺铂的实验浓度。（2）q-PCR和Western blotting的结果表明，顺铂刺激后c-MET基因的mRNA水平、总蛋白水平及活化后的磷酸化水平表达均下降;与单独顺铂刺激组（CIS组）相比，c-MET基因的mRNA、总蛋白、活化后的磷酸化表达水平在CIS+HGF组均显著提高，而使用JNJ38877605后，mRNA及总蛋白表达无显著差异，但其磷酸化激活水平显著下降。此结果说明，HGF可以促进c-MET的表达和活化;而JNJ38877605对c-MET基因的表达无明显影响，但对c-MET基因的磷酸化具有明显抑制作用。（3）CCK-8实验显示，与CIS组相比，CIS+HGF组细胞增殖活性增高，而CIS+JNJ组增殖活性降低。本实验说明，顺铂损伤细胞后，高表达HGF可激活c-MET保护细胞;而抑制c-MET蛋白的活化，会进一步加重细胞的损伤。另外，CIS+HGF组的细胞增殖活性虽有所增加但仍明显低于对照组，说明激活c-MET在一定程度上可以缓解顺铂造成的毛细胞损伤，但不能完全逆转该过程。（4）Western blotting检测LC3蛋白表达结果表明，与对照组相比，加入顺铂后的实验组自噬水平均有所提高;与CIS组相比，自噬水平在CIS+HGF组增高，在CIS+JNJ组降低;同时LC3双荧光自噬流检测结果显示，CIS+HGF组自噬过程最通畅，其次为CIS组，DMEM组和CIS+JNJ组自噬通畅度均较低;以上结果表明，c-MET激活后通过增强毛细胞的自噬水平对其发挥保护作用。（5）ROS检测结果说明，在无血清培养基组（DMEM-1组），细胞中活性氧的水平较低，而加入顺铂刺激后，各组细胞中的活性氧水平均增高;与CIS组相比，CIS+HGF组中细胞ROS的水平降低，而CIS+JNJ组中ROS的水平升高。本实验表明，激活c-MET在一定程度上抑制ROS的生成。 结论:（1）HGF/c-MET信号轴在顺铂损伤的毛细胞中发挥保护作用。（2）HGF/c-MET信号轴通过增强自噬，降低细胞中ROS的水平，减轻顺铂对毛细胞的损伤。
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