摘要
N6-甲基腺苷酸(m6A)是 mRNA 上已知的最普遍、丰度最高的化学修饰，主要分布于mRNA的终止密码子和3''UTR周围，并主要位于RRACH基序上。随着高通量测序技术的广泛应用，m6A修饰被证明在真核生物转录和 mRNA降解过程中具有重要的调节作用。以往对 m6A修饰的研究主要集中在 mRNA上，通过对新生 RNA的研究来进一步发现m6A修饰在两种RNA上的分布差异及其在转录本加工成熟中的功能。随着研究的逐渐展开，新生RNA上的m6A修饰对生物的调控功能也逐渐被发现。 为了探究m6A修饰在新生RNA与成熟RNA上的特征变化及其对生物学功能的影响，本研究由染色质结合RNA(Chromatin-binding RNA, cbRNA)代表新生RNA，通过对拟南芥cbRNA和mRNA MeRIP-seq数据进行分析，得到了m6A修饰图谱。m6A修饰图谱表明，在cbRNA中，m6A修饰主要位于CDS区，在mRNA中，m6A修饰主要位于 CDS和 3''UTR区域，且 mRNA上 3''UTR区域的 m6A所占比例显著高于cbRNA。此外，大部分转录本只包含1个m6A修饰区域，cbRNA中含有多个m6A修饰区域的转录本所占的比例高于 mRNA。将 MACS2鉴定的显著性 m6A修饰区间按cbRNA与mRNA修饰的变化分为三种，其中cbRNA上特有的m6A修饰区域5260个、mRNA上特有的m6A修饰区域11482个以及两者共有的m6A修饰区域2829个。GO富集分析显示，cbRNA特异的 m6A修饰基因主要富集于对压力的反应、盐胁迫反应、对刺激的反应等。mRNA特异的 m6A修饰基因富集结果中不再包含逆境相关条目，大多与合成代谢和转运相关。该结果表明在cbRNA转化为mRNA的过程中，很多逆境相关基因上的m6A修饰被去除掉了。 为进一步验证 m6A 修饰与逆境响应的关系，本研究将拟南芥进行盐胁迫处理，来进一步探究新生RNA m6A修饰对盐处理的响应。研究结果表明，盐处理后cbRNA上m6A的分布趋势基本不变，但修饰总数降低，含有两个及以上m6A修饰的转录本明显减少。将盐处理前后新生RNA与mRNA m6A修饰的分布变化进行统计，发现在盐胁迫下，cbRNA上的m6A修饰数量占正常状态下的32%。仅有25%的m6A修饰位点在cbRNA转化为mRNA的过程中被去除，远低于正常状态下的46%，大部分修饰在cbRNA转变为mRNA的过程中得到了保留。差异修饰基因的GO富集分析显示，盐处理后mRNA上新添加m6A修饰的基因同样富集在了胁迫应答相关条目中。这些结果表明盐胁迫可以使拟南芥中 m6A 修饰的分布发生改变，m6A 修饰会参与植物应对逆境的响应过程。 MTA是m6A甲基转移酶的关键基因，MTA基因突变会导致m6A修饰的合成显著下降。本研究对正常条件下野生型和mta突变体cbRNA数据进行RNA-seq分析，继续探究 cbRNA中 m6A修饰与基因表达的关系。结果表明，MTA突变后，cbRNA上的m6A修饰数量显著降低，由原来的5260个减少为17个。通过RNA-seq分析，共找到正常条件下野生型和mta突变体显著性差异表达基因815个，其中上调基因739个，下调基因76个。对突变后m6A修饰降低且表达减少的基因和m6A修饰降低且表达上升的基因分别进行 GO富集分析，结果表明 m6A修饰下调且基因表达降低的基因并不存在明显富集，但 m6A 修饰下调且基因表达上升的基因大量富集在了对刺激和压力的反应等过程中。该结果进一步表明，m6A 修饰可以参与到细胞应对胁迫响应的过程中，m6A修饰的减少会伴随着一些胁迫相关基因表达水平的升高。 组蛋白甲基化同样是细胞内的一种动态表观修饰，前人研究表明，组蛋白甲基化也可以参与到真核生物的细胞转录调控和生长发育过程中。为了探究 m6A 修饰与组蛋白修饰之间的关系，本研究继续结合 H3K4me3、H3K27me3和 H3K36me3三种组蛋白甲基化修饰数据进行探究。结果表明，H3K4me3和 H3K36me3修饰与转录早期cbRNA上的m6A修饰共定位相关性较强，而在cbRNA转化为mRNA的过程中，这种共定位相关性基本消失，而H3K27me3修饰与m6A修饰不存在共定位。 本研究基于新生RNA和mRNA的MeRIP-seq数据，结合组蛋白修饰数据，对新生 RNA转化为 mRNA过程中 m6A修饰的分布特征和功能进行深入研究。本研究在全基因组水平上构建了 cbRNA和mRNA m6A修饰图谱，探究了m6A修饰参与的生物学过程及其与基因表达的关系，同时结合组蛋白甲基化修饰数据，探究了 m6A 修饰与组蛋白甲基化之间的关系，有助于进一步探究植物中 m6A 修饰的生物学功能，为植物转录后调控研究提供新的思路与方法。
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