摘要
细菌和真菌感染均是威胁人类健康和安全的重要问题。迄今为止，抗生素治疗是细菌感染最常见的治疗方法。但抗生素的过度使用导致了多重耐药超级细菌的出现，它以各种方式对公众健康和环境构成巨大威胁。纳米酶催化的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)生成已成为对抗病原微生物的新策略。与天然酶的稳定性差、易失去活性、难以大规模制备等局限性相比，纳米酶具有制备简单、稳定性好、成本低等优点，这使得纳米酶有望在抗菌抗感染治疗领域得到应用。纳米酶的复杂组成和结构加上其相对较低的催化活性导致催化效率低，限制了其实际应用。基于此，有必要开发具有高效且广谱的非传统治疗药物，以有效杀死病原微生物。本文构建了一种基于手性半胱氨酸分子(L/D-Cys)功能化 Cu2-xSe 纳米颗粒(L/D-Cu2-xSe NPs)的多模式协同抗菌系统。其具有优异的光热效应和双酶催化活性，可以实现手性半胱氨酸/光热/化学动力/谷胱甘肽消耗多种模式协同抑菌。主要研究内容及结果如下： (1)采用水溶液法制备了具有手性的纳米酶。通过扫描电子显微镜(SEM)观察表明，制备的纳米酶为约75 nm的纳米粒子。通过圆二色谱(CD)、傅里叶红外光谱(FTIR)和紫外-可见光光谱(UV-Vis)等表征手段，表明纳米酶具有良好的光学活性和光学性能。 (2)通过理化性质测试表明，该手性Cu2?xSe纳米酶具有优异的光热性能和过氧化酶性能。L/D-Cu2?xSe NPs具有显著的近红外吸收，可以在激光照射下将近红外光能转化为热，由此产生的光热效应可以显著增强 L/D-Cu2?xSe NPs 的类谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-Px)催化活性。同时，经手性半胱氨酸分子修饰显著增强了Cu2?xSe NPs的谷胱甘肽消耗功能。45℃孵育60 min后，L/D-Cu2?xSe NPs的GSH清除率分别高达84.88 ± 1.39%和88 ± 2.78%，是Cu2?xSe NPs的2.5倍，从而可以产生更多的ROS，获得更好的体外抗菌性能。 (3)我们通过平板涂布法进一步研究了手性纳米酶的体外抗菌性能。Cu2?xSe NPs通过L/D-Cys的修饰显著增强了Cu2?xSe NPs的抑菌效果。10 μg/mL Cu2?xSe NPs处理的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为48.09±13.83%和50.53±2.08%。相同浓度下， L-Cu2?xSe NPs 处理后大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为 81.35±9.59%和66.15±1.03%， D-Cu2?xSe NPs 处理后大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为96.63±1.78%和79.34±1.61%。而无论是否修饰L/D-Cys，纳米酶对白色念珠菌的抑制率均高达 100%。与单独的过氧化物酶催化过程或光热处理相比， L/D-Cu2?xSe NPs+H2O2+NIR 组处理大肠杆菌的杀菌率分别分别高达 99.10±0.78%和 99.78±0.39%， L/D-Cu2?xSe NPs+H2O2+NIR 组处理金黄色葡萄球菌的杀菌率分别高达 92.16±3.25%和99.94±0.11%。这表明1064 nm激光诱导热疗和L/D-Cys的修饰可以促进酶催化，从而在促进纳米酶在体外快速有效地消除大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌。 (4)通过SEM观察及检测核酸和蛋白质的泄漏探究了抗菌机理。L/D-Cu2?xSe NPs既可以作为类过氧化物酶(Peroxidase, POD)纳米酶，又可以作为类谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)纳米酶。在光热/手性半胱氨酸分子的促进下，不仅能高效催化H2O2生成?OH，而且具有优异的GSH消耗能力。SEM观察得到，修饰手性半胱氨酸分子的纳米酶对细菌和白色念珠菌的细胞膜破坏作用更强烈，最终导致细胞内容物泄漏而死亡。 (5)细胞增殖和细胞毒性(CCK8)实验中，采用四个浓度的L/D-Cu2?xSe NPs处理两种细胞系时，细胞的相对活力均能保持在80%以上，证明手性Cu2?xSe纳米酶具有良好的体外生物相容性和安全性，可应用于生物体内实验。
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