摘要
可溶性甲烷单加氧酶sMMO是甲烷氧化菌中催化甲烷同化的关键酶。smmo基因簇包含8个保守基因，但其中由mmoD和mmoG基因编码的蛋白功能未知。本实验室前期结果表明，在菌株Methylotuvimicrobium buryatense 5GB1C中，MmoG可能是羟化酶α亚基的折叠伴侣，MMOD则可能是羟化酶的组装伴侣，但仍不清楚这两种蛋白在其他甲烷氧化菌中是否行使类似功能。另外，sMMO异源表达仍是该领域的一个难题。本研究以Methylomonas sp. LW13为材料鉴定其mmoD和mmoG的功能；另外，在不同宿主中尝试表达sMMO，所获结果归纳如下： 1. 菌株Methylomonas sp. LW13中mmoD和mmoG的功能鉴定 smmo是一个包含8个基因的基因簇，为了避免产生极性效应，本研究首先建立了一种高效的基因无痕敲除方法。pheS编码苯丙氨酰tRNA合成酶的α亚基，突变的PheSAG(T251A和A294G)在翻译过程中能够识别对氯苯丙氨酸并将其掺入蛋白质中，导致细胞死亡。基于此，我们突变了菌株LW13的pheS，并用强启动子Ptac和高效的核糖体结合位点RBSmmoX控制pheSAG的合成。基于反向筛选标记pheSAG的基因无痕敲除效率可达90%以上。 通过上述基因敲除技术，在菌株LW13中敲除mmoD或mmoG后通过萘氧化反应均检测不到sMMO酶活，分别回补敲除基因后又可恢复野生型性状，这与菌株5GB1C中的结果一致。荧光定量PCR结果显示敲除mmoD后smmo转录水平上调了约1倍，敲除mmoG后其转录水平下调了约9倍，而菌株5GB1C中敲除mmoD或mmoG后smmo转录水平均下调，这表明mmoG在这两种菌株中对smmo的转录可能发挥相同的调节作用，而mmoD在不同甲烷氧化菌中对smmo转录的影响可能各有差异。为了研究菌株LW13中二者的翻译后调节作用，使用组成型启动子Ptac控制smmo操纵子的转录（排除mmoD和mmoG对转录的影响）：在Ptac背景下，敲除mmoD或mmoG后萘氧化反应依然检测不到sMMO酶活，分别回补后酶活又可恢复，说明mmoD和mmoG在翻译后对sMMO的合成不可或缺，这与在菌株5GB1C中的结果也相同。 2. 异源表达sMMO 我们首先在Escherichia coli中重组表达来自5GB1C的sMMO，用T7或阿拉伯糖系统表达smmo基因簇时表达的sMMO活性极低，推测sMMO在大肠杆菌中表达时可能发生错误聚集，未能正确折叠或组装。于是进一步在E. coli中分别引入DnaKJE和GroEL/ES这两套伴侣蛋白系统，只有GroEL/ES单独与sMMO共表达时，萘氧化反应检测出明显的sMMO活性；Western blot可以检测到sMMO各组分蛋白；HPLC结果表明，表达的sMMO活性较无伴侣蛋白时提高约8倍，说明GroEL/ES可能辅助了sMMO正确折叠或组装。 其次，我们将来自5GB1C的sMMO导入Methylotuvimicrobium alcaliphilum 20Z(该菌无sMMO)和Pseudomonas putida KT2440中，萘氧化结果显示只有20Z(sMMO)突变株有显著的sMMO活性。 另外，我们分别以Methylobacterium extorquens AM1和Pseudomonas sp. XWY-1为宿主，建立了两套驯化体系，用于筛选sMMO功能性表达的菌株。菌株AM1能以甲醇为唯一碳源生长，sMMO的功能性表达将赋予该菌株利用甲烷生长的能力。由于菌株XWY-1能利用1-萘酚生长且sMMO能够将萘转化为1-萘酚，sMMO的功能性表达将赋予该菌株利用萘生长的能力。然而，经过2个月驯化，并未在AM1(sMMO)和XWY-1(sMMO)突变株中检测到sMMO活性。 综上所述，本研究表明在菌株LW13中mmoD和mmoG的功能与菌株5GB1C中具有相似性，mmoD和mmoG在转录水平和翻译后水平影响其sMMO的合成。在分子伴侣GroEL/ES辅助下，sMMO在E. coli中的表达活性提高。此外，建立的驯化体系为异源表达sMMO提供了一条新思路。这些研究为进一步阐明sMMO合成调控机制及其异源表达奠定基础，有利于未来其作为工业酶的发展应用。
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