摘要
柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus, CTV）和柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing, HLB）是柑橘最严重的两大病害，柑橘蚜虫和木虱分别是传播这两种病原物的重要害虫。柑橘是我国重要的经济作物之一，产量列世界第一位，所以防治柑橘衰退病和黄龙病有着巨大的经济意义及研究意义。目前控制柑橘蚜虫和木虱主要依赖使用农药等传统防治手段。农药防治害虫不仅对环境和人类产生危害，还会造成蚜虫和木虱的抗药性，因此需要寻找更加安全可持续的防治方法。RNA interference（RNAi）作为一种病虫防治方法已经被应用于一些农业保护领域，既包括害虫防治也包括益虫保护。小分子 RNA 因其结构设计简单、高度特异性，可以作为新型生物药剂为防治柑橘蚜虫和木虱导致的柑橘病害提供了新策略。本研究以豌豆蚜为研究对象，通过筛选高效靶标基因并合成dsRNA，尝试开发一个利用RNAi技术防治柑橘蚜虫的应用体系。依托这个体系，筛选出致死率较高的靶标基因，并在柑橘园中进行了应用性研究。具体研究内容如下： 1. dsRNA的合成及柑橘蚜虫靶标基因的筛选体系的建立 根据已有利用RNAi研究其他昆虫的文献选择候选靶标，并且在豌豆蚜中成功扩增出9个候选靶标基因片段。以靶标基因序列为模板，通过体外转录和细菌诱导表达的方式合成了 dsRNA。以豌豆蚜 ApAK 基因为模板合成 dsRNA，验证了其在柑橘蚜虫中最佳的dsRNA递送方式。本研究比较了3种递送dsRNA的方法，结果显示饲喂加浸泡法效果最佳。并以此方法为体系，在候选基因靶标中筛选到了ApAK，ApAll-A， Apabd-A，ApCth D等4个对豌豆蚜具有明显防治效果的基因。 2. ds-ApAK对柑橘蚜的防治结果及小分子RNA在植物系统中的传输 以上一章节筛选出的高效致死基因ApAK为靶标基因，使用浓度为400 ng/μL的ds-ApAK对豌豆蚜进行处理后，检测了对ApAK沉默效率。结果表明，在24 h，48 h， 72 h，其沉默效率分别为24.3%，48.2%，51.82%，进一步证实了ds-ApAK对豌豆蚜的生长发育起到抑制作用。使用ds-ApAK为材料在柑橘园中进行了小RNA药剂施用实验，发现浓度为400 ng/μL与浓度为800 ng/μL的小RNA药剂8 d致死率分别为56.88%，69.38%。高浓度的小RNA药剂会提高蚜虫死亡率，但效果不显著。将柑橘嫩梢浸泡在dsRNA溶液中，截取吸收dsRNA溶液后的柑橘嫩梢的叶片及茎枝验证，研究证明dsRNA能够通过植物传输系统在24 h之后可以传递8 cm，并且在自然条件下120 h还未降解。这对于防治以刺吸式口器的蚜虫等半翅目的昆虫是一个最佳的策略。 综上所述，我们根据柑橘蚜虫靶标基因合成dsRNA，抑制其表达，从而影响蚜虫的生长发育并导致死亡，达到切断柑橘衰退病传播途径的目的，克服了化学防治和物理防治存在的各种缺陷，为探索柑橘木虱的靶标基因筛选及 dsRNA 递送方式建立体系，并为防治柑橘黄龙病奠定基础。
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