摘要
湖羊是我国著名的地方绵羊品种，具有性成熟早、产羔多、耐湿热等优点，但其生长速度仍有待提高，而初生体重和断奶体重与后期生长发育高度相关，同时初生体重还与羔羊存活率关系密切，因此研究影响湖羊早期体重的基因具有十分重要的意义。研究发现多形性腺瘤基因1 （pleomorphic adenoma gene 1，PLAG1）敲除的小鼠胚胎生长受到抑制，表明其参与调控动物的生长发育。本课题组王悦等研究发现PLAG1 3′调控区g.8795 Cgt;T突变通过miR-139调控湖羊早期体重，但PLAG1在湖羊成肌细胞分化中的作用及5′调控区对湖羊早期体重的影响尚未见报道。本论文拟克隆湖羊PLAG1基因编码区序列，构建真核表达载体，转染成肌细胞，探讨PLAG1对成肌细胞分化的影响及机制，克隆PLAG1基因5′调控区序列，测定启动子区活性，分析 5′调控区 SNP 位点与湖羊初生体重和断奶体重的关联性，为解析湖羊早期体重的调控机制提供线索，为加快湖羊生长性状的选育进程提供候选的分子标记。全文研究内容如下： （1）PLAG1基因编码区序列克隆与分析 通过 PCR 方法发现湖羊 PLAG1 基因编码区序列存在两种长度不同的剪接体，命名为PLAG1L、PLAG1S，长度分别为1500bp、1254bp，对应两种isoform， N端相差82个氨基酸。RT-qPCR发现 PLAG1基因在湖羊骨骼肌中表达最高，通过 PSORTⅡProtein Sorting Prediction 进行 PLAG1 亚细胞定位预测，发现PLAG1L蛋白100%位于细胞核；PLAG1S蛋白91.3%位于细胞核，提示PLAG1L、PLAG1S主要在细胞核内发挥功能。 （2）PLAG1 isoform对湖羊成肌细胞分化的调控及机制 PLAG1L、PLAG1S表达载体分别转染湖羊成肌细胞，建立成肌细胞PLAG1L、PLAG1S表达模型并进行转录组测序。通过差异表达基因GO富集分析发现，与对照组相比，实验组部分差异表达基因注释到细胞进程、生长、繁殖有关的生物学过程，其中成肌细胞PLAG1L表达模型注释到45条，而PLAG1S表达模型注释到56条。包括IGF2表达上调，成肌细胞分化基因MYOD1、MYOG表达上调。KEGG富集分析发现成肌细胞PLAG1L、PLAG1S表达模型Wnt信号通路显著富集；与对照组相比，成肌细胞PLAG1L表达模型Wnt7b、Wnt11基因表达上调；成肌细胞PLAG1S表达模型中Wnt5b、Wnt7b基因表达上调；成肌细胞PLAG1L、PLAG1S表达模型Wnt经典通路关键基因β-catenin未差异表达。诱导分化实验发现，与对照组相比，成肌细胞PLAG1L、PLAG1S表达模型中与MYOD1、MYOG、MYH1 mRNA表达量上升（Plt;0.05）；MYH1蛋白表达量上升。Wnt家族基因Wnt5b、Wnt7b、Wnt11 mRNA 表达量上升(Plt;0.05）；利用转录因子结合位点预测数据库（http://jaspar2016.genereg.net/）发现Wnt5b、Wnt7b存在PLAG1蛋白结合位点，提示PLAG1可能直接作用于Wnt5b、Wnt7b调控其转录，激活非经典Wnt通路来促进成肌细胞分化。 （3）PLAG1基因5′调控区SNPs与湖羊早期体重的关联分析 利用5′RACE技术扩增PLAG1 mRNA 5′末端，发现存在5种5′UTR，转录起始位点相同且都位于PLAG1基因g.30535位点。双荧光素酶实验发现PLAG1基因核心启动子位于g.28882-g.29237位置。以湖羊为研究对象，筛选PLAG1基因5′调控区SNPs位点，共检测到15个连锁的SNPs位点分别为g.28888Agt;T、g.28901Ggt;T、g.28913Tgt;A、g.29717Ggt;C、g.29724Agt;C、g.29725Ggt;A、g.29768Tgt;C、g.29771Agt;G、g.30141Tgt;A、g.30144Agt;G、g.30691Cgt;A、g.30694Agt;T、g.30737Tgt;C、g.30802Cgt;T、g.30825Agt;G ，其中 g.28888Agt;T、g.28901Ggt;T、g.30802Cgt;T、g.30825Agt;G 位点与初生体重显著相关（Plt;0.05），g.30737Tgt;C 位点与断奶体重显 著 相 关 （ Plt;0.05 ） 。 单 倍 型 分 析 发 现AAGGTAGGAAGGTTAATTAACCAATCCCAA 单倍型与初生体重和断奶体重显著相关（Plt;0.05）。表明 PLAG1 基因 5′调控区存在 SNPs 与湖羊早期体重有关。 综上所述，湖羊 PLAG1 有 2 个 isoform，均可通过调控 Wnt5b、Wnt7b 和Wnt11的转录，激活非经典Wnt通路影响成肌细胞分化。PLAG1基因5′调控区g.28888Agt;T、g.28901Ggt;T、g.30802Cgt;T、g.30825Agt;G位点与初生体重显著相关（ Plt;0.05 ）， g.30737Tgt;C 位 点 与 断 奶 体 重 显 著 相 关 （ Plt;0.05 ）， AAGGTAGGAAGGTTAATTAACCAATCCCAA 单倍型与初生体重和断奶体重显著相关（Plt;0.05）。这些结果表明PLAG1对湖羊成肌细胞分化及早期体重具有重要影响。
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