摘要
精原干细胞（Spermatogonial stem cells，SSCs）的功能受到表观遗传修饰的严格调控。小RNA（MicroRNA，miRNA）和组蛋白甲基化等表观遗传学修饰从转录水平调控基因表达。miR-101 通过靶基因调节细胞的增殖、分化和凋亡。果蝇 Zeste 基因增强子人类同源物2（Enhancer of zeste homolog 2，EZH2）是组蛋白H3第27位赖氨酸（Lysine-27 of histone H3，H3K27）的甲基转移酶，在小鼠精原细胞和胚胎干细胞的增殖、分化及衰老等过程中发挥重要作用。然而，miR-101-5p和EZH2在山羊睾丸组织中的表达及对山羊SSCs的作用鲜有研究。因此，本研究首先检测miR-101-5p及EZH2 在性成熟前后山羊睾丸组织中的表达，其次以山羊 SSCs 为研究对象，探索miR-101-5p 及 EZH2 对山羊 SSCs 增殖、细胞周期及多能性的影响，旨在揭示miR-101-5p影响山羊SSCs生物学特性的分子机制。试验结果如下： 试验一、miR-101-5p的表达及其对山羊SSCs增殖和凋亡的影响 本试验采用qPCR解析miR-101-5p在性成熟前后山羊睾丸组织中的表达水平，并通过转染 miR-101-5p 的抑制剂（inhibitor）和模拟物（mimics）检测其对山羊 SSCs生物学特性的影响。结果表明，与性成熟前相比，性成熟后山羊睾丸中 miR-101-5p的表达水平极显著升高（Plt;0.01）；过表达miR-101-5p后，SSCs的活力极显著下降（Plt;0.01），促凋亡基因CASP3和CASP9的表达极显著上升（Plt;0.01），而抑凋亡基因BCL-2的表达极显著下降（Plt;0.01），细胞周期G2/M期比例显著下降（Plt;0.05），多能性基因NANOG和CDX2及精子发生相关基因GDNF和DAZL的表达均极显著下降（Plt;0.01），但是干扰miR-101-5p后其趋势相反。上述结果说明miR-101-5p能够促进山羊SSCs的凋亡，抑制其增殖能力，阻滞细胞周期，影响多能性基因表达。 试验二、miR-101-5p靶向EZH2调控山羊SSCs增殖和凋亡的研究 本试验旨在探索miR-101-5p影响山羊SSCs生物学特性的分子机制，通过双荧光素酶报告载体、qPCR和Western blot试验探究miR-101-5p调节靶基因参与调控山羊SSCs增殖和凋亡的作用机理。结果表明，与共转染EZH2-WT及NC mimics相比， EZH2-WT和miR-101-5p mimics共转染后，荧光素酶活性极显著下降（Plt;0.01），但是其它组无显著差异（Pgt;0.05）；与NC相比，过表达miR-101-5p能够极显著降低山羊SSCs中EZH2的蛋白及mRNA水平（P lt; 0.01）。此外，与性成熟前相比，amp;nbsp;性成熟后山羊睾丸中EZH2的表达水平极显著升高（Plt;0.01），进一步研究发现EZH2在山羊SSCs中的表达极显著高于（Plt;0.01）间质细胞和支持细胞；干扰EZH2后山羊SSCs的活力、增殖能力极显著下降（Plt;0.01），细胞周期G2/M期受阻（Plt;0.01）；细胞增殖marker基因PCNA和抑凋亡基因BCL-2的表达量极显著下降（Plt;0.01），而促凋亡基因P53、BAK、CASP3、CASP9、BAX及BAX/BCL-2的表达水平极显著升高（Plt; 0.01）。干扰EZH2后，山羊SSCs中PLZF、GDNF等marker基因及DAZL的表达极显著降低（Plt;0.01）。上述结果说明，miR-101-5p靶向EZH2促进山羊SSCs的凋亡，抑制其增殖能力，阻滞细胞周期，降低自我更新marker基因的表达，可能影响了山羊的精子发生过程。 试验三、EZH2调控山羊SSCs多能性的分子机制 DNA 甲基化和基因组印记是基因选择性转录表达的调控方式，EZH2 能够影响Dnmt1 的表达，在许多基因甲基化过程中发挥重要作用。为了验证 EZH2 是否通过DNA甲基化影响山羊SSCs多能性及印记基因的表达，本试验通过qPCR、Western blot和BSP技术探究EZH2对山羊SSCs多能性基因、印记基因及其DNA甲基化的影响，旨在阐明EZH2调控山羊SSCs多能性的分子机制。结果表明：与NC相比，干扰EZH2后，山羊SSCs中多能性基因OCT4、NANOG及印记基因H19的表达水平均极显著降低（Plt;0.01），同时DNA去甲基化转移酶TETs（Tet1、Tet2和Tet3）的表达水平也极显著下降（Plt;0.01），而Dnmt3a和Dnmt3b的表达极显著升高（Plt;0.01）。此外，干扰EZH2后，NANOG基因第4个位点的甲基化水平下降，印记基因H19（Plt;0.05）和IGF2（Plt;0.01）的甲基化水平显著上升，故推测EZH2通过DNA甲基化影响山羊SSCs的基因组印记，但是对多能性的影响并不依赖于DNA甲基化。
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