摘要
马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata）属鞘翅目叶甲科，是破坏性极强的检疫性害虫，造成马铃薯产量和品质的巨大损失。作为第4大类杀虫剂，新烟碱类以其作用机制独特、高效、低毒、环境安全成为防治马铃薯甲虫的主要药剂之一。随着使用的普及和频繁，国内外抗性调查发现马铃薯甲虫已对吡虫啉、噻虫嗪等新烟碱类药剂产生了不同水平的抗性。阐明相关抗药性分子机制对于延缓抗性加剧及延长该类药剂的使用寿命非常重要。本研究于 2019 年监测新疆不同地区马铃薯甲虫成虫对噻虫嗪和吡虫啉的抗性水平，测定比较不同田间种群及噻虫嗪胁迫下3种主要解毒酶的活性差异，利用转录组分析抗性相关的差异表达基因，利用 RT-qPCR 技术分析 7 个田间种群以及噻虫嗪LD50处理72 h后的6个P450基因的表达水平，通过抗性倍数与表达量变化的相关性分析筛查与噻虫嗪、吡虫啉抗性相关的 P450 基因，并通过昆虫杆状病毒系统体外成功表达重组蛋白CYP9Ya，进一步利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS）技术检测CYP9Ya对噻虫嗪和吡虫啉的代谢产物。主要研究结果如下： 1.新疆马铃薯甲虫成虫对噻虫嗪和吡虫啉的抗性监测 利用点滴法对新疆乌鲁木齐（URMQS、URMQT、URMQB）、吉木萨尔（JMS）、察布查尔（QPQL）、伊宁（YNY、YNH）7 个马铃薯甲虫田间种群成虫进行噻虫嗪和吡虫啉的抗性监测。抗性测定结果表明，URMQS 种群对噻虫嗪的 LD50最低，为24.7 ng·头-1，与之相比，URMQT和URMQB种群对噻虫嗪保持敏感，抗性倍数（RR）都低于3倍；QPQL、YNH种群为敏感性降低，RR分别为3.4和4.5倍；YNY和JMS种群则达到中水平抗性，RR分别为11.8和14.0倍。URMQB种群对吡虫啉的LD50最低，为38.3 ng·头-1，以此作为相对敏感种群，JMS、YNH、QPQL种群均对吡虫啉表现均为敏感性降低，RR分别3.1、3.3和4.3倍。本研究揭示了新疆马铃薯甲虫田间种群对噻虫嗪和吡虫啉的敏感性现状，可为合理应用噻虫嗪和吡虫啉防控马铃薯甲虫提供理论依据。 2.新疆马铃薯甲虫不同种群及噻虫嗪处理后解毒酶活性测定 本研究分别对马铃薯甲虫7个田间种群以及噻虫嗪LD50处理4个马铃薯甲虫种群成虫72 h后的解毒酶活性进行测定，分析马铃薯甲虫对噻虫嗪抗性的生化机制。与URMQS相比，在4龄幼虫中，YNY和QPQL种群GST（以DCNB为底物）以及URMQB种群EST活性分别显著升高2.89、2.13及1.34倍；成虫中，YNY种群P450酶、GST （以CDNB为底物）以及YNH种群GST（以DCNB为底物）活性分别显著增加1.56、1.26及1.81倍。噻虫嗪LD50处理成虫72 h可引起URMQS、UQMQT相对敏感种群以及YNY、JMS抗性种群P450活性都显著增加，分别为对照组的1.76、2.75和1.91、1.66倍。综合上述结果分析，P450可能在马铃薯甲虫对噻虫嗪的解毒代谢中起主要作用。 3.新疆马铃薯甲虫敏感和抗性种群的转录组分析及验证 通过构建转录组测序文库并结合数字基因表达（DGE）对抗性（JMS）和敏感（URMQT）种群进行测序，并运用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术验证3个上调的P450基因CYP4C1、CYP9e2、CYP305a1的表达情况。转录组分析表明通过合并组装分别获得噻虫嗪敏感和抗性种群样品56 872 051和62 249 136个原始序列数据以及55 903 706和61 082 076个过滤后的序列数据，过滤后的序列长度分别为8.39和9.16 G；碱基错误率均为0.03%；抗性种群中差异表达的P450基因13个，GST基因1个，EST基因7个，未见显著差异表达的GST和EST基因。其中，CYP4C1、CYP9e2分别显著上调13.45倍、4.44倍，CYP305a1上调3.6倍。定量PCR检测结果显示， CYP4C1、CYP9e2和CYP305a1分别显著上调了5.03、5.32和8.01倍，与DEG测序结果基本一致。另外对已报道的美国长岛吡虫啉抗性种群中3个过表达的P450基因CYP9Ya、CYP9Yc和CYP9Z25表达量分析显示，CYP9Ya 在JMS 种群显著上调 1.68倍。 4.新疆马铃薯甲虫不同种群及噻虫嗪处理后细胞色素P450基因的表达量分析 利用RT-qPCR分析CYP9Z25、CYP9Ya、CYP9Yc、CYP4C1、CYP9e2和CYP305a1 6个P450基因在不同种群及噻虫嗪处理后的表达情况，明确该虫与新烟碱类杀虫剂抗性相关的P450基因。与URMQS相比，4龄幼虫中，CYP4C1、CYP9Z25在YNH种群的表达量分别显著增加6.74和4.15倍；CYP9e2、CYP305a1在JMS种群的表达量分别显著增加5.35和21.95倍。QPQL种群CYP9Ya、CYP9Yc分别显著上调3.51和3.11倍。成虫中，CYP4C1、CYP9Yc在YNY种群的表达分别显著上升5.56和4.03倍， JMS种群的CYP305a1及YNH种群的CYP9Z25表达量分别显著增加6.6和7.49倍。经噻虫嗪LD50处理72 h，UMRQS种群4龄幼虫和成虫CYP9Ya和CYP9Yc均显著上调1.5-3.0倍。另外相关性分析显示成虫对噻虫嗪的抗性水平与CYP9Ya基因表达量呈显著相关。CYP9Ya 的生长发育表达谱分析表明，该基因在马铃薯甲虫各个生长发育阶段均有表达，其中 4 龄幼虫中表达量最高，为卵的 6.03 倍，这可能与该基因在 4龄幼虫期发挥重要作用相关。根据上述结果推测CYP9Ya可能参与了马铃薯甲虫对噻虫嗪抗性的产生。 5.细胞色素P450基因CYP9Ya的体外表达及对噻虫嗪和吡虫啉的代谢研究 本研究利用昆虫杆状病毒表达系统，对CYP9Ya进行体外蛋白表达。通过对空载pFastBacHTA、CPR及CYP9Ya P3代病毒进行空斑分析，获得病毒滴度，CYP9Ya的滴度为4×107 pfu·mL-1，空载FastBac-HTA和CPR滴度为7×107 pfu·mL-1。利用CO差光谱法检测P450含量，图谱中在450 nm处出现最大吸收峰，表明其在体外表达成功实现了结构折叠且保持结构完整，然后根据450-490 nm间的吸光度差计算P450含量为378.9 pmol·mg protein-1。动力学法测定结果显示，分别以PNA和ECOD为底物的CYP9Ya酶活性为对照组的2.7和3.3倍。利用UPLC-QTOF-MS技术检测发现，CYP9Ya可以将噻虫嗪代谢为噻虫胺，将吡虫啉代谢为5-羟基吡虫啉。
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