摘要
大豆[Glycine Max (L.) Merr.] 起源于中国，是一种重要的油料和高蛋白作物。盐害作为一种主要的非生物胁迫，对大豆生长发育的各个时期均有不利的影响，最终会导致产量和品质的下降。因此，寻找大豆耐盐相关基因并研究其分子机制，通过分子育种手段培育耐盐大豆品种是解决这一问题行之有效的方法。 植物耐盐性是一种多基因调控的复杂数量性状，且受到环境的影响很大。在本课题组的前期研究中，张威（2019）利用包含 184 个家系的重组近交系（RIL）群体鉴定到与大豆耐盐性相关的主效QTL（Quantitative trait loci） qST-8。qST-8与本课题组前期发现的耐盐标记Sat_162紧密连锁，且在多个耐盐指标的多年多点环境重复中被共定位到。有趣的是，全基因组关联研究（GWAS）确定了与萌发期耐盐性状显著相关的几个单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphisms，SNPs）也位于8号染色体上该QTL的置信区间内。通过对连锁分析所用群体的父母本（母本：科丰1号，父本：南农1138-2）进行重测序，对候选区间基因进行生物信息学和基因表达分析，最终确定萌发期耐盐相关候选基因为GmCDF1。 本研究通过酵母突变体，检测GmCDF1对钠钾离子的选择透过性，验证GmCDF1作为编码阳离子通道蛋白基因的跨膜运输功能；通过酵母双杂交技术筛选并鉴定与GmCDF1互作的蛋白，进而研究GmCDF1与互作蛋白在大豆盐胁迫过程中的调控机制；获得GmCDF1相关植物材料，包括mtp12（At2G04620：GmCDF1同源基因）拟南芥突变体纯合株系和GmCDF1过表达转基因大豆植株以及利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得的GmCDF1基因定点突变转基因大豆植株。主要的研究结果如下： 1. 利用全基因组重测序产生的多态性标记对栽培大豆和野生大豆两个自然群体中GmCDF1进行单倍型分析，可以将219份栽培大豆材料中216份材料，121份野生大豆材料中37份材料分为五种主要的单倍型。其中，Hap3和Hap4的相对发芽率（ST-GR）明显低于Hap1、Hap2和Hap5。对这五种单倍型包含的253份材料进行了系统发育进化分析，在进化关系上，也是分成了五个主要分支，在每个分支中，不同材料的表型存在着相似性。根据重组自交系群体父母本中 GmCDF1 的启动子测序结果，我们发现科丰1号的GmCDF1启动子序列相比于南农1138-2的GmCDF1启动子序列存在大片段缺失差异，使用PlantCARE在线网站分析两种材料启动子区的顺式作用元件，我们发现两种材料 GmCDF1 启动子区均包含了很多光响应顺式作用元件、多个厌氧诱导顺式作用元件和多种激素响应元件等。同时使用 PlantPAN 数据库进一步对两种材料启动子序列进行转录因子结合位点预测，我们发现，WRKY等转录因子最有可能直接结合到 GmCDF1 的启动子区域，随后对父母本差异区段分析后发现，科丰1号GmCDF1的启动子序列的缺失片段存在大量的WRKY转录因子结合位点，其次是 MADS-BOX 转录因子，暗示了这两种转录因子与 GmCDF1 在调控植物生长发育以及胁迫应答过程中的联系。 2. 分析盐胁迫诱导后GmCDF1基因在萌发期和苗期的表达模式：南农1138-2和科丰 1 号中 GmCDF1 在两个时期同一种材料中的表达模式相似，GmCDF1 在南农1138-2中响应盐胁迫，而在科丰1号中始终不响应盐胁迫。在野生豆极端材料中，不论是萌发期还是苗期，GmCDF1的表达水平变化都不明显，且基础表达水平相对较低。基于GmCDF1含有离子通道蛋白相关功能域，我们构建pYES2-GmCDF1重组表达载体转入钠、钾吸收缺陷型酵母突变体进行酵母突变体功能互补试验，结果如下：钠敏感型酵母菌株B31对Na+极其敏感，当NaCl浓度达到75 mM时，转入AtHKT1;1的酵母菌株由于Na+的过度流入已经基本不生长，转入pYES2空载的阴性对照仍可以生长正常，转入 GmCDF1 的酵母菌株较转入空载的阴性对照生长明显受到抑制，说明GmCDF1在较高浓度NaCl下具有向胞内转入钠离子的功能，但比AtHKT1;1要弱。在低浓度KCl培养基中酵母钾吸收缺陷型菌株CY162生长受到抑制，在含6 mM 的KCl的培养基上，转化AtKAT1的酵母菌株生长很好，转入pYES2空载的阴性对照则生长缓慢，而转入 GmCDF1 的酵母菌株回补能力与转入空载的菌株差不多，即GmCDF1对低浓度的钾离子几乎没有通透能力。GmCDF1的亚细胞定位表明GmCDF1位于细胞膜和细胞核。为鉴定 GmCDF1 的调控网络，进行了酵母双杂交筛选互作蛋白试验，结果如下：通过酵母双杂交筛选大豆叶 cDNA 文库，获得了两个互作蛋白：GmVSR3-1和GmVSR3-10。这两个互作蛋白具有相同的注释：液泡分选接收器3。随后在烟草中进行体内BiFC（(Bimolecular Fluorescent Complimentary，双分子荧光互补试验）验证GmCDF1与GmVSR3-10的互作，并且发现互作发生在细胞核内。 3. 使用 pSCM-2sgRNA-GmCDF1, pSCM-4sgRNA-GmCDF1, 35S-GmCDF1 和GmUBI-GmCDF1四种敲除载体分别转化发根农杆菌K599，并诱导两种大豆材料（Jack和NJAU-C204）的毛状根，统计毛状根突变率以及突变类型：pSCM-2sgRNA-GmCDF1在两种材料毛状根中导致的基因突变率分别为 71.4 %和 50 %；pSCM-4sgRNA-GmCDF1在两种材料毛状根中导致的基因突变率均为66.67%；35S-GmCDF1在两种材料毛状根中导致的基因突变率分别为40%和56.67%；GmUBI-GmCDF1在两种材料毛状根中导致的基因突变率分别为83.4%和56.67%。将PBA002-GmCDF1过表达载体和GmUBI-GmCDF1敲除载体分别转化根癌农杆菌EHA105，用于侵染大豆子叶节进行遗传转化，共创制了8株过表达和7株敲除转基因大豆株系。在T1代GmCDF1过表达植株中检测 GmCDF1 的表达量，在各个株系中表达量出现不同程度的上升，表明成功过表达目的基因。
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