摘要
目的： 本研究的目的是探究KKS在椎间盘退变（IVDD）过程中发挥的部分作用。首先，证实KKS是否存在于人椎间盘的髓核中，以及与椎间盘的退变相关性；其次，阐明BK在氧化应激下NPCs及IVDD中的作用，为临床上靶向KKS治疗和延缓IVDD提供实验依据。 实验方法： 1、KKS与IVDD的相关性研究 根据Pffirmann IVDD分级标准收集了10例临床髓核组织标本，其中5例为正常或轻度退变（Ⅰ级和Ⅱ级），5例为重度退变（Ⅲ级~Ⅴ级）。采用病理学方法观察轻度和重度退变的组织标本的细胞及组织特征，使用WB的手段检测髓核不同退变等级在分子水平表达的差别，同时使用免疫组织化学和WB的方法，验证KKS（包括KNG、B1R、B2R）是否存在于人的髓核组织中，以及在不同退变等级髓核组织中的表达情况。 分离并提取人和大鼠原代NPCs用于研究，分别用引起髓核退变的重要生物因子IL-1β、TNF-α和TBHP干预人和大鼠的原代NPCs，利用PCR、WB及免疫荧光的手段证实NPCs中存在KKS的主要成分并与NPCs的退变相关。 2、BK在TBHP干预后NPCs中的作用及机制研究 培养大鼠原代NPCs，首先将实验分组为：Control组、BK干预组、TBHP干预组和BK+TBHP干预组。采用CCK-8、DCFH-DA荧光探针、JC-1线粒体膜电位检测、Hoechst33258染色、β-半乳糖苷酶衰老染色、流式细胞术、免疫荧光及WB等方法研究BK对TBHP诱导的NPCs氧化应激、凋亡、衰老、细胞外基质代谢以及PI3K/AKT通路的影响。其次将实验分组为：Control组、TBHP干预组、BK+TBHP干预组、HOE140+BK+TBHP干预组和LY294002+BK+TBHP干预组。利用上述手段验证BK是否通过激活B2R/PI3K/AKT通路保护细胞免受TBHP诱导的凋亡、衰老及细胞外基质降解。 3、正交设计优化BK/PLGA缓释微球的制备及体外药物释放研究 用复乳溶剂挥发法制作BK/PLGA缓释微球，以微球对BK的载药率和包封率为主要考察指标，对不同的PLGA溶液浓度、内水相BK的药物浓度、外水相PVA的浓度、搅拌转速四个工艺条件进行四因素三水平的正交实验。对优化后微球的表征和体外药物释放进行测定研究，并与大鼠原代NPCs共培养观察其对细胞活力的影响。 4、BK/PLGA微球延缓IVDD的动物实验研究 细针穿刺法构建大鼠尾椎IVDD模型并注入BK/PLGA微球，在大鼠体内验证BK能否治疗或者延缓IVDD。方法：将SD大鼠27只，随机分为3组：假手术组（Sham）、椎间盘退变组（IVDD）及IVDD+BK/PLGA微球组（IVDD+BK Microspheres），每组9只。术后严密监测大鼠尾巴穿刺部位伤口外观和大鼠一般行为。于术后当天、1月和2月时每组随机抓取3只大鼠安乐处死，进行X线、MR影像学及病理组织学观察BK/PLGA微球对退变椎间盘髓核的治疗作用。 结果： 1、人髓核组织及人、大鼠NPCs中发现存在KKS，且与IVDD相关 通过WB检测髓核组织中细胞外基质、衰老和凋亡标记物的表达，在分子水平验证所收集的组织样本的退变程度，并通过免疫组化证明了髓核组织中存在KKS的主要成分:KNG-1、B1R和B2R，且它们在退变的NP组织中高度表达。PCR及WB的手段也证实了NPCs中存在KNG-1, B1R和B2R，且其表达量在干预后升高，与退变相关。 2、BK通过激活B2R/PI3K/AKT通路保护细胞免受TBHP诱导的凋亡、衰老及细胞外基质降解 BK呈剂量依赖性提高大鼠NPCs的活力，降低正常NPCs中活性氧（ROS）的产生。BK预处理可以显著降低TBHP引起的ROS升高，恢复线粒体膜电位，升高Bcl-2保护细胞中线粒体的功能，挽救NPCs免受TBHP诱导的凋亡。同时，细胞的衰老染色结果显示，BK可以减轻TBHP诱导的NPCs衰老，其BK干预组的衰老标志物（P53、P21和P16）也是降低的。此外，BK还促进了细胞外基质合成代谢增加，蛋白聚糖（Aggrecan）和Ⅱ型胶原蛋白（Collagen-Ⅱ）表达升高，降低了细胞外基质分解代谢标志物金属蛋白酶3 （ MMP-3 ）和金属蛋白酶9amp;nbsp;（MMP-9）的表达。在抑制B2R和PI3K/AKT通路后，BK无法减少TBHP诱导的NPCs凋亡、衰老和细胞外基质降解。 3、BK/PLGA缓释微球体外药物释放稳定，生物相容性好 使用复乳溶剂挥发法制备BK/PLGA缓释微球，正交优化制备微球的实验结果显示，PLGA投入量为100 mg，BK投入量为0.5 mg，PVA为1.5%，搅拌速率为400 r/min是制备微球的最优条件，使用此条件制备出了形态规整，粒径80μm左右，包封率为74.10 ± 9.17%，载药率为0.370 ± 0.046%，缓释超过28d的BK/PLGA缓释微球。体外与大鼠原代NPCs共培养结果显示，BK/PLGA微球无明显毒性，能提高NPCs活力，有轻微促增殖能力。 4、BK/PLGA微球延缓了细针穿刺后大鼠的IVDD进程 通过术后当天、1月和2月的时间点，用钼靶X线、MR、病理切片等手段观察，结果表明，术后IVDD组在1月后髓核水化消失，椎间高度下降，椎间盘发生退变；IVDD+BK Microspheres组在1月和2月的时间点上一定程度的维持着髓核的水化和椎间高度延缓了椎间盘的退变。同样，尾椎标本的病理切片和免疫组化结果也证实了BK/PLGA缓释微球在椎间盘局部缓释靶向KKS ，调控IVDD中细胞外基质代谢不平衡，实现IVDD中ECM的稳定，恢复组织功能，促进NP再生，延缓了大鼠尾椎椎间盘的退变。 结论： 我们的研究首次发现了人椎间盘组织和NPCs中存在KKS并参与椎间盘的退行性变；证明了BK部分激活B2R及其下游PI3K/AKT通路，在高ROS条件下对NPCs的有益保护作用。KKS在IVDD中发挥着重要作用，以B2R为靶点，构建的BK/PLGA缓释微球在治疗IVDD和促进椎间盘髓核再生方面具有巨大潜力。
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