摘要
目的：研究纤溶酶原PLG（Plasminogen, PLG）是否通过抑制肝癌细胞Anoikis现象和通过增强肝癌细胞Anoikis抵抗的作用来影响肝癌细胞增殖、侵袭及迁移的能力，并探讨线粒体能量代谢和氧化磷酸化途径是否是 PLG 发挥上述作用的相关机制。 方法：（1）通过在线生物信息学方法分析了 PLG在肝癌患者中的表达情况及其预后价值；（2）通过免疫组织化学染色法、蛋白免疫印迹技术（Western Blot, WB）检测PLG在肝组织和配对癌旁组织中的表达水平，并通过单因素卡方分析PLG的表达水平和肝癌患者临床病理特征间的关系，使用单因素Cox 回归方法分析影响肝癌患者预后的因素，以及 PLG 表达水平高低在肝癌患者中的预后价值；（3）通过流式细胞术检测并分析肝癌细胞在贴壁和悬浮状态下的凋亡情况；（4）通过 Western Blot 技术检测肝正常细胞 L-02 和不同肝癌细胞系 Huh7、HCCLM3、MHCC97-H、SMMC-7721、Hep3B中 PLG的蛋白表达水平，然后将上述选中继续实验用的细胞系SMMC-7721及HCCLM3做悬浮24h处理，然后检测其在贴壁和悬浮状态下PLG的表达变化情况；（5）利用特异性 PLG shRNA慢病毒内源性下调肝癌细胞SMMC-7721和HCCLM3中 PLG的表达，然后采用流式细胞术检测下调 PLG 后贴壁和悬浮状态下肝癌细胞 SMMC-7721 和HCCLM3 凋亡情况的变化及影响。接着通过平板克隆增殖形成实验、Transwell实验及划痕实验检测下调PLG对肝癌细胞SMMC-7721和HCCLM3增殖能力、侵袭及迁移能力的影响；（6）使用 NOD/SCID 小鼠皮下成瘤，通过比较肿瘤体积及重量变化验证 PLG 下调对肿瘤进展的影响。（7）通过 WB 技术验证 PLG是否通过调控线粒体能量代谢途径中丙酮酸脱氢酶激酶（PDKs）来抑制肝癌细胞Anoikis现象和增强肝癌细胞失巢凋亡(Anoikis)抵抗作用。 结果：（1）在线生物信息学分析结果提示在低分化肝癌、HBsAg(+)肝癌、没有血管侵犯的肝癌中，PLG 高表达肝癌患者的生存预后更差，其总体生存期OS 和 PFS 均短于 PLG 表达低的患者；（2）肝癌患者组织样本免疫组化和 WB结果表明PLG在肝癌组织的表达相对较配对癌旁组织高，并且激活的PLG主要定位于细胞核中，PLG高表达的肝癌患者预后差；AFP、肿瘤大小和PLG表达水平是影响肝癌患者预后不良的独立危险因素；（3）WB 证实了 PLG 在肝癌患者癌组织和肝癌细胞中高表达，悬浮处理肝癌细胞 SMMC-7721、HCCLM3 后PLG的表达水平较贴壁状态下表达高；（4）贴壁状态下肝癌细胞SMMC-7721、HCCLM3和肝正常细胞L-02的凋亡率无明显差异，但悬浮 24 h 后，肝癌细胞SMMC-7721和 HCCLM3的凋亡率低于肝正常细胞L-02；（5）贴壁状态下，与肝正常细胞L-02 相比，PLG蛋白在肝癌细胞SMMC-7721和 HCCLM3 中的表达升高，且在悬浮 24 h 后，PLG蛋白在 SMMC-7721 和 HCCLM3 中的表达水平升高，而在L-02中无明显变化；（6）在贴壁状态下，与对照组相比，下调 PLG表达的肝癌细胞SMMC-7721和 HCCLM3中凋亡率无明显变化；而在悬浮状态下，下调 PLG表达后SMMC-7721和 HCCLM3凋亡率比sh-Ctrl 组升高，并且其增殖、侵袭和迁移的能力也明显下降；（7）与 sh-Ctrl 组相比，sh-PLG 组小鼠皮下成瘤的体积小且重量轻；（8）PLG 可能通过调控 PDK1/2/4 途径增强肝癌细胞失巢凋亡(Anoikis)抵抗。 结论：PLG在肝癌组织和肝癌细胞系中高表达，且有抑制肝癌细胞Anoikis现象的作用，PDK1/2/4可能是调控PLG抑制肝癌细胞Anoikis现象或增强失巢凋亡(Anoikis)抵抗作用的机制之一。
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