摘要
灰飞虱Laoadelphax striatellus（Fallén）是一种重要的农业害虫，因长期使用化学药剂，灰飞虱已经对多种杀虫剂产生了抗性。细胞色素P450s作为生物体内重要的解毒酶，其活性的增强是灰飞虱产生抗药性和交互抗性的重要机制。新烟碱类杀虫剂是继有机磷、氨基甲酸酯和拟除虫菊酯类杀虫剂之后的又一类重要杀虫剂。已有研究表明稻飞虱对吡虫啉、啶虫脒、噻虫嗪和呋虫胺等新烟碱类杀虫剂产生了抗性和交互抗性，究竟是哪些P450s酶可以介导飞虱对新烟碱类杀虫剂产生交互抗性尚不清楚。为了回答上述问题，本文利用转基因果蝇过表达技术和生物测定的方法，在 62 个灰飞虱细胞色素 P450s 中进行了筛选，并对筛选出来的 P450s 进行体外表达和功能验证，主要研究结果概括如下： 1．62个过表达灰飞虱P450s基因的果蝇对啶虫脒、噻虫嗪和呋虫胺的生物测定 利用啶虫脒、噻虫嗪和呋虫胺对62个过表达灰飞虱P450基因果蝇品系进行生物测定，实验品系为纯和转基因果蝇品系雄（雌）虫与da-Gal4品系果蝇雌（雄）虫杂交后代，对照品系为9755果蝇品系雄（雌）虫与da-Gal4品系果蝇雌（雄）虫杂交后代。结果显示：与对照dagt;9755相比，过表达果蝇品系dagt;CYP6ER2对三种杀虫剂的敏感性均显著降低；dagt;CYP6CS2v1和dagt;CYP15G1对啶虫脒和呋虫胺的敏感性显著降低；dagt;CYP3115A1和dagt;CYP6AX对啶虫脒和噻虫嗪的敏感性显著降低。生物测定结果筛选出的灰飞虱CYP6CS2v1、CYP6ER2、CYP3115A1、CYP6AX和CYP15G1可能参与灰飞虱对新烟碱类杀虫剂交互抗性的形成。 2. 灰飞虱CYP6CS2v1、CYP6ER2和CYP15G1的体外表达 利用昆虫杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达了 CYP6CS2v1、CYP6ER2 和CYP15G1酶。通过CO差光谱法测定了3个灰飞虱P450酶的含量和光谱特征。结果显示：这3个重组P450酶与CO结合后都在450 nm处有最大吸收峰，说明这3个P450蛋白性质稳定并具备P450酶的特征；利用450 nm与490 nm间的吸光度差值和摩尔吸光系数计算得到这3个P450酶的含量分别为：284.11 pmol/mg protein、219.78 pmol/mg protein和137.36 pmol/mg protein。分别测定了重组CYP6CS2v1、CYP6ER2和CYP15G1酶对对硝基苯甲醚（PNA）、7-乙氧基香豆素（EC）、和甲氧基试卤灵（MR）的代谢活性。结果显示：CYP6CS2v1和CYP6ER2对PNA有较高的氧脱甲基活性，比活力值分别是2.27和2.06；三个P450酶对EC都显示出了较高的氧脱乙基活性，比活力值分别是2.34、2.54和2.10；三者对底物MR都没有代谢活性。 3. 灰飞虱 CYP6CS2v1、CYP6ER2和 CYP15G1 对啶虫脒、噻虫嗪和呋虫胺的体外代谢作用初探 将重组灰飞虱CYP6ER2和CPR混合，与啶虫脒孵育3 h，以重组pFastBacHTA为阴性对照，通过UPLS-MS检测得到代谢产物是去甲基啶虫脒，具有特征为209.05 m/z 的质谱峰，在对照组和其他 2 个重组 P450 酶对啶虫脒的代谢产物中并未发现去甲基啶虫脒。因此，可以确定灰飞虱CYP6ER2能够代谢啶虫脒为去甲基啶虫脒；在CYP6CS2v1、CYP6ER2和CYP15G1对噻虫嗪的代谢试验中，CYP6ER2可以代谢噻虫嗪为噻虫胺，其代谢速率为 0.0102±0.0010 pmol/min/pmol P450 ，显著高于pFastBacHTA阴性对照，代谢动力学研究结果显示：CYP6ER2代谢噻虫嗪时，代谢产物噻虫胺的生成具有时间依赖性；并且测得 CYP6ER2 的动力学参数 Km 值为94.56±5.74μM，内在清除率（Vmax/Km）为0.00011；CYP6CS2v1和CYP15G1对噻虫嗪代谢速率与阴性对照相当，因此CYP6CS2v1和CYP15G1对噻虫嗪无代谢活性。3个重组 P450 酶对呋虫胺的代谢试验中均未检测到可能的呋虫胺代谢产物。因此，代谢试验结果证实，灰飞虱CYP6ER2对啶虫脒和噻虫嗪具有代谢活性，是介导灰飞虱对新烟碱类杀虫剂产生交互抗性的P450酶。
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